导读
近日，国家纳米中心的梁兴杰研究员与清华大学化学系的李景虹教授合作，开发了一种碳点支撑的原子尺度分散的金（carbon-dot-supported atomically dispersed gold，CAT-g）材料作为一种新型抗癌纳米材料，具有良好的抗癌疗效和生物安全性，相关成果发表在Nature Nanotechnology上（DOI https://doi.org/10.1038/s41565-019-0373-6）
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线粒体氧化还原稳态（mitochondrial redox homeostasis，MRH）在细胞生物合成、信号传导和凋亡中扮演着关键角色。癌细胞作为细胞界的异兽，其线粒体中的MRH自然与普通细胞不一样：活性氧（ROS）和抗氧化剂（如谷胱甘肽，GSH）的水平都显著升高。MRH是癌症治疗的一个潜在靶标，因为破坏MRH可以引起ROS快速富集，诱发癌细胞凋亡。但是目前却没有有效的策略靶向MRH，主要原因有两点：第一，清除线粒体中的GSH很困难；第二，在线粒体中产生毒性水平的ROS也很困难。异硫氰酸盐虽然可以快速高效结合GSH，但胞质中高水平的GSH往往会使它在到达线粒体之前失活；而线粒体中快速升高的ROS则会被高水平的GSH中和。因此同时清除GSH并增加ROS是靶向MRH治疗肿瘤的有效策略。而近年的研究发现在原子尺度上分散在支撑物上的金属是一种效价比极高的催化剂，其极高的金属原子利用率可用于清除细胞中的GSH。但是开发生物相容性良好、毒性低且具有较高金属负载率的材料仍然是一个挑战。
图1. MitiCAT-g设计概念和作用机理，图片来源Nat. Nano.
为此，国家纳米中心的梁兴杰研究员与清华大学化学系的李景虹教授合作，开发了一种碳点支撑的原子尺度分散的金（carbon-dot-supported atomically dispersed gold，CAT-g）材料，完美解决了以上问题。他们在CAT-g表面修饰了可以产生ROS的肉桂醛（cinnamaldehyde，CA）和可以靶向线粒体的三苯基膦（triphenylphosphin, TPP），这种纳米材料可以清除线粒体中的GSH并增加ROS诱发癌细胞凋亡，经过瘤内注射后，可以显著杀伤癌细胞，抑制肿瘤生长，同时不损伤正常组织。相关研究成果与于近日发表在Nature Nanotechnology上，题为“Carbon-dot-supported atomically dispersed gold as a mitochondrial oxidative stress amplifier for cancer treatment”，梁兴杰组博士生宫宁强为论文第一作者。
纳米颗粒设计与表征
作者通过两步法制备了3种碳点支撑的金（Carbon-dot-supported gold，Au/CDs），金的负载率分别为0.5%（Au/CDs1）、15.3%（Au/CDs2，CAT-g）、45.7%（Au/CDs3）。Au/CDs1和Au/CDs2中存在金原子和小的金原子团簇，而Au/CDs3中只有金纳米颗粒。通过与GSH-Rho孵育，作者发现Au/CDs2可以最高效地清除GSH。这主要是由于Au/CDs1和 Au/CDs2中的金原子高度分散，而Au/CDs2金原子含量高于Au/CDs1，且其金原子分散程度高于Au/CDs3。尽管如此，CAT-g的细胞毒性却很低，作者认为这是由于细胞质中高水平的GSH在CAT-g进入细胞后就立刻与之结合。为此，作者将CA和TPP分别修饰在了CAT-g表面形成了MitoCAT-g，其中TPP负责线粒体靶向，而CA负责产生ROS。
图2.MitiCAT-g制备及表征，图片来源Nat. Nano.
MitoCAT-g的细胞毒性和胞内分布
作者在细胞水平测试了一系列材料的细胞杀伤能力，发现只有MitoCAT-g(64 μg/ml)可以在24小时内杀伤90%的癌细胞，但是对正常的细胞却没有太大影响，同时MitoCAT-g对高表达超氧化物歧化酶-2（SOD2）和过氧化氢酶HepG-2肝癌细胞的毒性较小。这表明MitoCAT-g对癌细胞的毒性是通过放大线粒体的氧化应激产生的。
共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察发现共孵育0.5小时后，MitoCAT-g就被细胞膜包裹，2小时后有68%与线粒体共定位，有29%与内涵/溶酶体共定位，但是没有TPP的材料则主要在内含体和细胞质中。作者发现MitoCAT-g会破坏线粒体的形貌，主要影响包括线粒体面积和周长变小，线粒体嵴消失。
图3. MitiCAT-g的亚细胞分布，图片来源Nat. Nano.
MitoCAT-g放大线粒体氧化应激、导致HepG-2细胞凋亡
接下来，作者研究了MitoCAT-g对HepG-2细胞线粒体中GSH的影响。作者发现MitoCAT-g可以将线粒体GSH降低至对照组的12%，12小时后细胞质中的GSH也被清除。此外，作者还利用CLSM观察发现MitoCAT-g可以显著升高细胞质和线粒体中的ROS。MitoCAT-g优先在线粒体产生ROS，随后诱发细胞质中产生ROS，同时研究还表明MitoCAT-g先清除了GSH，然后再产生了ROS。
由于线粒体与凋亡有关，因此作者猜想线粒体中氧化应激的放大可能会诱发细胞凋亡。和对照组材料相比，MitoCAT-g可以诱发PARP-1和pro-caspase-3发生最高水平的切割，且会出现大量的DNA碎片，这表明凋亡程度最高。作者还通过流式细胞术进行了检测，结果确实表明MitoCAT-g可以有效诱发细胞凋亡。进一步实验发现MitoCAT-g会降低癌细胞线粒体膜电位和氧消耗，这表明MitoCAT-g放大的氧化应激通过改变线粒体膜电位并降低氧消耗导致了细胞凋亡。
图4. MitiCAT-g放大氧化应激并导致凋亡，图片来源Nat. Nano.
MitoCAT-g抗癌疗效研究
接下来作者在两种肿瘤模型中研究了MitoCAT-g的抗癌疗效。第一种模型是HepG-2的皮下模型，给药方式为隔天一次的瘤内注射（每只小鼠64 μg）。对照组小鼠的肿瘤疯狂生长，不到40天所有小鼠全部死亡。而80%的实验组小鼠在31天时没有肿瘤，62天时有87.5%的小鼠存活。这表明MitoCAT-g具有很强的抗癌效应。
图5. MitiCAT-g在皮下肿瘤模型中的抗癌疗效，图片来源Nat. Nano.
第二种模型是病人来源的肝细胞癌原位移植模型（HCC PDX）。作者通过超声引导的瘤内注射方式将药物进行肝癌原位注射进行治疗，同时用临床使用的疗法——原位注射乙醇或者乙酸作为对照。结果发现43天时对照组小鼠全部死亡，而实验组的老鼠在79和94天分别有87.5%和75%的小鼠存活，组织切片观察发现MitoCAT-g治疗的小鼠的肿瘤中出现更多的凋亡细胞。同时，MitoCAT-g对正常的肝组织没有任何损伤，对其他主要器官（心、肺、脾、肾）都没有明显组织变化，对肾功能和肝功能没有明显影响，也没有引起任何系统免疫反应。这些数据表明MitoCAT-g是一种安全无毒的抗癌新药。
图6. MitiCAT-g在HCC PDX模型中的抗癌疗效，图片来源Nat. Nano.
总结：在这项最新研究中，作者开发了一种线粒体氧化应激放大器（MitoCAT-g），可以通过清除线粒体中的GSH并产生ROS来进行肿瘤治疗。这种放大器富含高度分散的金原子，因此可以以极高的利用率来清除GSH，放大CA诱导的ROS对线粒体的损伤，导致线粒体膜电位变化以及氧摄入降低，最终引起细胞凋亡。而在小鼠体内的皮下以及HCC PDX模型中，MitoCAT-g都展现出了较强的抗肿瘤能力，同时对于正常器官组织无明显副作用。这表明这是一种具有潜力的安全有效抗癌新策略。
参考资料：Xingjie Liang et al.Carbon-dot-supported atomically dispersed gold as a mitochondrial oxidative stress amplifier for cancer treatment. Nature Nanotechnology. 2019. https://doi.org/10.1038/s41565-019-0373-6
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