高压灭菌 vs 过滤除菌：TSB 制备工艺对无菌检查结果的影响

在药品、生物制品及医疗器械的无菌检查中，胰酪大豆胨液体培养基（TSB, TrypticSoy Broth）是最常用的需氧菌和兼性厌氧菌增菌培养基之一。培养基的灭菌方式直接影响其营养成分完整性、促生长能力以及最终无菌检查结果的可靠性。本文从工艺原理出发，系统对比高压蒸汽灭菌与过滤除菌两种方式对 TSB 性能及无菌检查结果的影响，并给出实操选择建议。

01 TSB 培养基与无菌检查的基本要求

胰酪大豆胨液体培养基（TSB），又称胰蛋白胨大豆肉汤，是一种通用营养培养基，用于培养需氧菌、兼性厌氧菌及真菌。根据《中国药典》通则 1101（无菌检查法），TSB 的标准配方为：胰酪蛋白胨 17.0 g、大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0 g、氯化钠 5.0 g、磷酸氢二钾 2.5 g、葡萄糖 2.5 g，纯化水加至 1000 ml。灭菌后 pH 值应在 7.1～7.5 范围内。

药典明确要求：培养基配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2～25°C、避光环境中；密闭容器保存可使用一年，非密闭容器一般三周内使用。

02 高压蒸汽灭菌：标准工艺与潜在风险

标准灭菌参数

TSB 的常规高压灭菌条件为 121°C 保持 15 分钟，或 116°C 保持 30 分钟。这一参数组合在制药行业被广泛验证，能够有效杀灭包括芽孢在内的各类微生物。

对培养基成分的影响

高压灭菌虽为药典推荐的标准方法，但高温过程并非零损伤。TSB 中含有葡萄糖（还原糖）和蛋白胨（富含氨基酸），在 121°C 长时间加热条件下会发生以下变化：

美拉德反应（非酶褐变）：葡萄糖与氨基酸在高温下发生缩合反应，培养基外观从淡黄色逐渐变为琥珀色甚至深褐色。含糖量越高、灭菌时间越长，褐变越明显。

营养成分降解：部分氨基酸在高温下降解或外消旋化，维生素类生长因子失活，导致培养基实际营养浓度低于理论配方值。

pH 偏移：高温加速糖类分解产酸，可使灭菌后 pH 值较理论值下降 0.1～0.3 个单位。

副产物生成：美拉德反应产物中部分大分子氨基糖颗粒具有弱抑菌作用，可能抑制对环境敏感的菌株生长。

对无菌检查结果的影响

上述变化在常规条件下通常不会导致检验失败，但在以下场景中可能成为风险来源：

方法适用性试验：当培养基促生长能力下降时，低接种量（不超过 100 CFU）的验证菌株可能生长迟缓或不生长，导致方法适用性试验判定失败。

低污染样品的检出：若供试品仅含少量受损或应激状态的微生物，营养受损的培养基可能无法支持其复苏，造成假阴性结果。

多次分装后重复灭菌：实验室为节省时间将剩余培养基重复高压灭菌，累积热损伤显著增加，促生长能力逐次下降。

03 过滤除菌：热敏保护与应用局限

原理与操作

过滤除菌通过 0.45 μm（或更小孔径）的微孔滤膜物理截留细菌和真菌细胞，全程在室温或低温下操作。对于 TSB 这类基础培养基，通常先将各组分溶解后，经预滤去除大颗粒，再通过 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤除菌，无菌分装至已灭菌容器中。

核心优势

完全避免热损伤：不发生美拉德反应，培养基保持原始色泽，氨基酸、维生素等热敏营养成分完整保留。

pH 值稳定：无高温分解导致的 pH 偏移，配制后调节的 pH 值可精确维持。

无沉淀生成：避免高温引起的组分间反应析出，培养基澄清透明。

局限性与注意事项

不能去除病毒和支原体：过滤仅截留细菌和真菌，病毒和支原体可能穿过滤膜。过滤后的培养基仍需做无菌检查确认无菌落生长方可使用。

操作要求高：过滤需在洁净台或隔离器内进行，对环境洁净度和操作人员无菌技术要求更高，操作不当引入的污染风险可能高于高压灭菌。

过滤吸附损失：TSB 浓度较高时过滤速度慢，且蛋白胨等大分子成分可能吸附在滤膜上造成营养损失。

耗材成本：一次性滤膜和滤器耗材成本高于高压灭菌，批量处理效率较低。

04 两种工艺的关键维度对比

05 如何选择：工艺决策的实操建议

对于绝大多数无菌检查实验室，高压蒸汽灭菌是 TSB 制备的首选标准工艺。理由如下：

药典明确收载：《中国药典》通则 1101 直接给出了 TSB 的处方和灭菌条件，方法适用性试验和监管检查均以此为基准。

无菌保障更可靠：高压灭菌的无菌保障水平极高，不受操作环境波动影响。

成本与效率优势明显：批量灭菌一次完成，无需持续消耗耗材。

但在以下特定场景中，应考虑过滤除菌或组合方案：

培养基配方含热敏成分时：如添加了维生素、生长因子、抗生素或血清的改良 TSB，应将基础培养基高压灭菌后冷却至 45～50°C，再无菌加入经过滤除菌的热敏添加剂。

方法适用性试验反复失败时：若怀疑培养基促生长能力下降，可对比过滤除菌制备的平行样品，排查热损伤是否为失败原因。

模拟灌装试验：部分企业在培养基模拟灌装试验中倾向使用新鲜配制、单次灭菌的培养基，确保最高促生长能力，以支持最差条件下的检出验证。

无论选择哪种方式，以下质控环节不可省略：

无菌检查：每批配制的培养基均需留样培养确认无菌。

促生长试验：按药典要求接种标准菌株，检查生长情况。

pH 复核：灭菌或过滤后实测 pH，确认在 7.1～7.5 范围内。

保存条件与效期：密闭 2～25°C 避光保存，在验证有效期内使用。

06 商业培养基选择参考：青岛海博生物TSB 系列

在实际工作中，使用经过标准化生产的商业脱水培养基，可以有效减少实验室自行配制过程中的变量。青岛高科技工业园海博生物技术有限公司（青岛海博生物）成立于 2000 年，是国内微生物检测培养基领域的专业生产企业，产品覆盖中国药典和 GB 标准要求的各类无菌检查培养基。

青岛海博生物的 TSB 相关产品包括：

胰酪大豆胨液体培养基（中国药典版）：植物源配方，适用于微生物增菌培养及无菌模拟灌装。

胰蛋白胨大豆肉汤（食品检验版）：符合 GB 4789.43 标准。

颗粒培养基：预包装颗粒剂型，减少称量误差。

该系列产品的主要特点为：每批产品经过促生长试验验证，配方批间一致性较好；提供植物源和动物源不同配方选择；配套培养基配制与使用的技术咨询服务。

07 结论

高压蒸汽灭菌与过滤除菌各有适用场景。在常规无菌检查中，121°C/15 分钟高压灭菌是 TSB 的标准工艺，无菌保障可靠、成本可控，且符合药典要求。过滤除菌虽能更好地保留营养成分，但受限于操作环境要求和耗材成本，更适合作为含热敏成分的改良培养基或方法适用性失败时的排查手段。

无论采用哪种工艺，培养基的批间一致性和促生长能力验证才是决定无菌检查结果可靠性的核心。选用经过标准化生产和验证的商业脱水培养基，配合规范的灭菌操作和完整的质控流程，是降低检验风险、确保结果可信的务实路径。