AbMole 抑制剂篇丨 Z-DEVD-FMK：高选择性 Caspase-3 抑制剂，在凋亡级联通路与细胞命运研究中的应用

摘要：Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134，CAS No.：210344-95-9）是 Caspase-3 的高选择性不可逆肽类抑制剂。Caspase-3 是细胞凋亡执行阶段的核心效应蛋白酶，负责剪切 PARP、ICAD、ROCK1 等数百种底物，决定凋亡的形态学与生化表型。Z-DEVD-FMK 以 DEVD 四肽识别序列靶向 Caspase-3 活性中心，不可逆阻断其蛋白酶活性，是解析凋亡执行机制、区分凋亡与坏死，以及保护性干预研究的经典工具。

一、Z-DEVD-FMK的分子作用机制
Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134，CAS No.：210344-95-9）由 DEVD 识别肽段、苄氧羰基（Z）保护基与氟甲基酮（FMK）亲电基团构成。DEVD 序列对应 Caspase-3 的 P4-P1 底物识别基序，赋予其高度底物特异性——对 Caspase-3 的抑制活性较 Caspase-8 等起始型 Caspase 高约一到两个数量级；FMK 基团与 Caspase-3 活性中心半胱氨酸形成共价硫醚键，实现不可逆抑制。在凋亡级联中，线粒体外膜通透化释放的细胞色素 c 与 Apaf-1、Caspase-9 组装凋亡小体，激活 Caspase-9，后者切割激活 Caspase-3，启动执行程序：剪切 ICAD 释放 CAD 核酸酶造成 DNA 梯状降解，剪切 PARP 阻断 DNA 修复，剪切 ROCK1 驱动细胞膜泡化与凋亡小体形成。Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134，CAS No.：210344-95-9）在执行节点阻断级联，使研究者能够区分上游信号事件与下游执行表型——例如 PARP 剪切被阻断而线粒体膜电位下降仍发生，即可判定损伤定位于上游。这种节点特异性是广谱 Caspase 抑制剂所不具备的优势。

二、Z-DEVD-FMK在细胞层面研究中的应用
在细胞层面，Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134，CAS No.：210344-95-9）有着较为广泛的应用。在 HeLa、Jurkat 或 SH-SY5Y 细胞中，以 10~50 μM的Z-DEVD-FMK 预处理细胞 1~2 h，再加星形孢菌素（Staurosporine，1 μM）或依托泊苷（Etoposide）诱导凋亡：对照组 24 h 凋亡率约 50%～60%，而预处理组 Annexin V 阳性率降至 10% 以下，PARP 剪切条带几乎完全消失，DNA梯状降解被阻断，而线粒体膜电位下降（JC-1红绿比）不受影响，提示细胞的凋亡被阻断。Caspase-3活性荧光底物（Ac-DEVD-AMC）检测显示，10 μM Z-DEVD-FMK 能抑制 90% 以上的酶活。该化合物还广泛用于：缺血缺氧损伤模型的凋亡机理分析、免疫细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）研究，以及Caspase剪切底物谱（蛋白质组）分析中的阴性对照。

三、Z-DEVD-FMK在动物实验研究中的应用
在动物层面，Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134，CAS No.：210344-95-9）的应用也同样广泛。例如在动物神经系统与缺血再灌注损伤模型中被用于分析组织细胞的凋亡情况。有研究在大鼠局灶性脑缺血模型中经侧脑室给予 Z-DEVD-FMK（参考剂量 10~50 nmol，损伤前或损伤即刻给药），脑梗死体积较对照组缩小约 30%～40%，伴随 TUNEL 阳性细胞减少与神经功能评分改善，在体证明 Caspase-3 是脑缺血神经元死亡的关键执行者。Z-DEVD-FMK也能用于脊髓损伤、心肌缺血再灌注与肝损伤模型：在损伤急性期给予 Z-DEVD-FMK，可显著降低组织 Caspase-3 活性与凋亡细胞比例，并改善功能评分与组织细胞凋亡。需要强调的是，Z-DEVD-FMK 在动物实验中经全身给药后，穿透血脑屏障能力有限，因此中枢研究多采用侧脑室或鞘内给药；而外周模型可经腹腔或静脉途径给药（参考剂量 1~5 mg/kg）。

范例详解
BMC Biol. 2021 May 20;19(1):108.
AbMole 的 Z‑DEVD‑FMK（AbMole，M3134）在上述研究中被用作Caspase‑3 选择性抑制剂，用于K562细胞，和多种抗肿瘤抑制剂共同处理细胞，结合 SMS 单分子测序平台开展转录组检测，辅助参与 vlincRNA 调控网络的构建，用于探究 vlincRNA 参与 DNA 损伤应激、细胞生存相关的调控机制，后续结合 RAT 染色质互作实验、CRISPR‑Cas13 敲低实验评估 vlincRNA 对基因的顺式与反式调控功能。

图 Properties of vlincRNA regulatory networks.

四、Z-DEVD-FMK相关细胞实验（文献参考举例）
该方案适配凋亡执行阻断、Caspase-3 活性与剪切底物检测。
细胞系：人宫颈癌 HeLa 细胞或人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞
检测指标与方法：Z-DEVD-FMK（10、25、50 μM）预处理 1~2 h，星形孢菌素（1 μM）或依托泊苷（50 μM）诱导凋亡 24 h；Annexin V-FITC/PI 流式定量凋亡率；Western blot 检测 cleaved caspase-3、cleaved PARP；Ac-DEVD-AMC 荧光底物法检测 Caspase-3 活性；TUNEL 染色；JC-1 检测线粒体膜电位。
给药浓度：10~50 μM
处理时长：预处理 1~2 h；诱导后检测 12~24 h
参考文献：Slee E A, Harte M T, Kluck R M, et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. Journal of Cell Biology, 1999, 144(2): 281-292.
*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。*

五、Z-DEVD-FMK相关动物实验（文献参考举例）
该方案适用于缺血再灌注与神经损伤模型的凋亡归因研究。
动物模型：C57BL/6 小鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）局灶性脑缺血模型
给药配制：Z-DEVD-FMK 以无菌生理盐水或人工脑脊液配制，侧脑室注射
给药剂量：参考剂量 10~50 nmol/只（侧脑室）
给药方案：栓塞前 30 min 或再灌注即刻侧脑室注射；再灌注 24 h 后评估脑梗死体积（TTC 染色）、神经功能评分，取缺血半暗带组织检测 Caspase-3 活性、cleaved caspase-3 与 TUNEL 阳性细胞数。
参考文献：Endres M, Namura S, Shimizu-Sasamata M, et al. Attenuation of delayed neuronal death after mild focal ischemia in mice by inhibition of the caspase family. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 1998, 18(3): 238-247.
*注：上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献调整。*

总结
综上，Z-DEVD-FMK（AbMole，M3134）以 DEVD 序列的底物特异性与 FMK 基团的不可逆抑制特性，成为凋亡机制研究中的重要工具之一。在体外细胞模型和动物实验（如缺血再灌注、中枢神经损伤等模型）中均有着重要的应用。
*本文所述均为科研试剂，仅供科学研究参考

参考文献
[1] Nicholson D W, Ali A, Thornberry N A, et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature, 1995, 376(6535): 37-43.
[2] Thornberry N A, Rano T A, Peterson E P, et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(29): 17907-17911.
[3] Slee E A, Harte M T, Kluck R M, et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. Journal of Cell Biology, 1999, 144(2): 281-292.
[4] Earnshaw W C, Martins L M, Kaufmann S H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annual Review of Biochemistry, 1999, 68: 383-424.
[5] Endres M, Namura S, Shimizu-Sasamata M, et al. Attenuation of delayed neuronal death after mild focal ischemia in mice by inhibition of the caspase family. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 1998, 18(3): 238-247.
[6] McStay G P, Salvesen G S, Green D R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation, 2008, 15(2): 322-331.