FSHW | 醛酮还原酶的底物口袋重塑，提高其对3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇的解毒活性

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Introduction

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又称呕吐毒素，主要是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌侵染谷物后产生的一种有毒次级代谢物，主要存在于霉变的玉米、小麦、大麦等谷物类作物及其制品中。因其理化性质稳定，易与其他霉菌毒素共同污染农作物，且具有广泛毒性，给畜牧业健康养殖带来巨大的经济损失。

DON脱毒方法可以分为物理脱毒、化学脱毒和生物脱毒三类。物理脱毒和化学脱毒方法存在脱毒不彻底、存在化学残留等问题而限制了其在食品和饲料工业中的应用。而生物脱毒法因其具有绿色、安全、高效等优势，在食品加工和食品安全领域有着广阔的应用前景。DON分子中C3位上的羟基和C12/13位上的环氧基团作为DON的主要毒性基团，也是生物脱毒主要的研究位点。其中，研究最为透彻的是C3位上的羟基的差向异构化，其主要由两步反应组成，第一步是由吡咯喹啉醌（PQQ）依赖的醇脱氢酶将DON氧化为低毒的3-酮基-DON（3-keto-DON），再经NADPH依赖的醛酮还原酶还原生成无毒的 3-异构-DON（3-epi-DON），实现DON的脱毒（图1）。与DON相比，3-keto-DON和3-epi-DON的毒性都有所降低，尤其是3-epi-DON的毒性比DON低1 181 倍，这表明第二步是DON差向异构化过程的关键步骤。然而，目前发现的具有DON解毒功能的醛酮还原酶种类少且催化活性低，严重限制了其在食品和饲料工业中的应用。

图1 DON的C3位生物降解途径

此前，研究人员从德沃斯氏菌（Devosia）A6-243中发现了2 种DON降解酶DADH和AKR13B3，其中PQQ依赖的醇脱氢酶DADH将DON转化为3-keto-DON，然后经醛酮还原酶AKR13B3将3-keto-DON降解为3-epi-DON。但是，野生型AKR13B3的催化活性有限，限制了其在食品和饲料工业中的进一步应用。此外，AKR13B3的高热稳定性意味着它是一种潜在的通过蛋白质工程提高其催化活性的理想候选酶，以控制谷物生产过程中的DON污染。

Results and Discussion

通过减小空间位阻重塑AKR13B3的底物口袋

研究发现，除了3-keto-DON以外，AKR13B3还对小分子底物2-呋喃糠醛（2-FAL）、丁醛（BAL）和戊二醛（GAL）表现出催化活性，且显著高于对大体积底物3-keto-DON的催化活性（图2）。通过三维结构模拟和分子对接发现，小分子底物GAL、2-FAL和BAL都能被容纳在底物结合腔中，而非天然大体积底物3-keto-DON却不能以相对合理的构型容纳在底物结合口袋中。此外，底物口袋入口处的关键残基M28和R134可能会产生空间阻碍，阻止大体积底物进入，从而导致AKR13B3对3-keto-DON的催化活性较差（图3）。结构引导的空间阻碍工程是提高催化活性的一种有效方法。基于此，作者将M28和R134突变为空间位阻较小的氨基酸（缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、胱氨酸和丝氨酸），以减少潜在的空间位阻，获得一个酶活显著提高的突变体M28S，其对3-keto-DON的催化活性是野生酶的11.02 倍。

图2 AKR13B3对不同底物的催化活性

图3 野生型AKR13B3与不同底物的分子对接及其突变体的催化活性

计算机辅助技术提高AKR13B3的催化活性

为进一步提高其催化活性，作者通过分子对接，确定底物结合口袋附近的13 个关键氨基酸残基（图4）。之后，计算了这些氨基酸残基的结合能和突变能，最终选择了S65、S97、N100和L105进行饱和诱变，经过高通量筛选，从饱和突变文库中获得了催化活性显著提高的突变体S65V，其催化活性是野生型AKR13B3的27.70 倍。进一步经过组合突变，获得了酶活进一步提高的双点突变体M28S/S65V，该突变体的催化活性是野生型AKR13B3的43.11 倍，为其在食品和饲料工业中的应用奠定了基础。

图4 计算机辅助技术提高AKR13B3的催化活性

催化活性提高的分子机制研究

为了确定AKR13B3突变体催化活性提高的分子机制，对AKR13B3/NADPH/3-keto-DON和 M28S/S65V/NADPH/3-keto-DON复合物结构进行了结构分析、分子对接和分子动力学模拟，发现大体积氨基酸的突变会导致底物口袋构象重排和底物口袋体积的扩大，有利于大体积底物在底物结合腔内的正确定位，从而提高其催化活性（图5）。此外，分子动力学模拟表明，底物亲核攻击距离的缩短以及底物口袋柔性的增强有利于底物的进入和产物的释放，是其酶活提高的主要原因（图5）。

图5 AKR13B3催化活性提高的分子机制

Conclusion

此前，从德沃斯氏菌（Devosia）A6-243中发现了2 种DON降解酶，其中DADH将DON降解为毒性较低的3-keto-DON，AKR13B3将3-keto-DON降解为相对无毒的3-epi-DON。然而，AKR13B3较低的催化活性阻碍了其在食品和饲料工业中的实际应用。在本研究中，作者基于空间位阻工程，结合计算机辅助技术，提高了AKR13B3对大体积底物3-keto-DON的催化活性,与野生型AKR13B3相比，最优突变体M28S/S65V对非天然底物3-keto-DON的催化活性提高了43.11 倍。此外，分子动力学模拟表明，底物结合口袋重塑有效缩短了底物的亲核攻击距离，有利于大体积底物的结合和释放，从而提高其催化效率。

第一作者简介

牛家峰，男，南京农业大学在读博士生，主要研究方向为霉菌毒素的生物控制；酶的分子设计等。目前主持江苏省研究生科研与实践创新计划项目1 项，参与国家自然基金面上项目2 项，在国内外期刊公开发表学术论文10余篇，其中1作发表SCI论文8 篇，中科院1区7 篇，申请国家发明专利3 项，授权1 项，受理2 项。

通信作者简介

吕凤霞，女，南京农业大学食品科技学院教授，博士生导师，长期从事食品微生物与生物技术、食品酶学、以及酶在农产品深加工与转化中的应用研究，尤其在新型食品用酶的结构与功能、酶分子改造、酶分子克隆、基因表达、工业发酵到后提取及酶的应用等方面开展过大量的研究工作。作为主持人和主要参加人参加国家科技部“十二五”项目、国家“863”、国家自然科学基金和省级科研项目十多项。研究成果“净菜加工流通技术与应用研究”获2006年教育部科技进步二等奖(第六完成人)。近年来，在国内外核心期刊发表论文100多篇，其中被SCI收录70多篇，获发明专利12 项，申请专利4 项，鉴定成果2 项.

Reshaping the active pocket of an aldo-keto reductase to enhance its detoxification activity towards 3-keto-deoxynivalenol

Jiafeng Niua, Bin Maa, Hao Zhua, Huawei Liub, Haizhen Zhaoa, Xiaomei Biea, Fengxia Lua,*, Ping Zhua,*

a College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

b State Key Laboratory of Desert and Oasis Ecology, Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830000, China

*Corresponding authors.

Abstract

Deoxynivalenol (DON), the most common mycotoxin in the world, poses serious health hazards to both humans and animals and causes significant economic losses to the food and feed industry. An intriguing method for DON detoxification involves enzymatic cascade catalysis by pyrroloquinoline quinone-dependent alcohol dehydrogenase (DADH) and aldo-keto reductase (AKR13B3). However, the poor catalytic activity of AKR13B3 has limited its usefulness. Here, structure-guided steric hindrance engineering, computer-assisted protein engineering, and combinatorial mutagenesis were carried out to increase the catalytic efficiency of AKR13B3. The best mutant in this project was M28S/S65V, which outperformed wild-type AKR13B3 in terms of catalytic efficiency (kcat/Km) and specific activity by factors of 44.07 and 41.65, respectively. Kinetic parameter determination revealed that the enhanced catalytic efficiency of M28S/S65V toward 3-keto-DON was attributed to the decreased Km and increased kcat values. Moreover, the engineered enzyme was applied to degrade DON in contaminated corn steep liquor, for a 90.62% removal rate. Structure-based computational analysis provided insights into the enhanced catalytic efficiency of M28S/S65V, which was attributed to the enlarged substrate-binding pocket and reshaped pocket with a favorable hydrophilic attack distance. The results provide a reference for improving the catalytic activity of an enzyme toward non-native bulky substrates and pave the way for the development of enzymes as detoxification agents to mitigate DON in the food and feed industry.

Reference:

NIU J F, MA B, ZHU H, et al. Reshaping the active pocket of an aldo-keto reductase to enhance its detoxification activity towards 3-keto-deoxynivalenol[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250194. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250194.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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