江西师范大学张琪团队合作Org. Lett.：次壳层酶工程提升核苷酶的催化活性

导语

核苷类似物是抗病毒和抗肿瘤药物的重要结构类型，但传统化学合成通常依赖多步保护基操作，还要同时处理区域选择性和立体选择性。嘌呤核苷磷酸化酶可以在温和水相条件下催化核苷转糖基化，为此类分子的制备提供了另一条路径。不过，酶能够结合底物，并不等于底物会以适合反应的构象进入催化过程。江西师范大学/复旦大学张琪团队及其合作者以细菌霍烷化合物生物合成酶HpnG为研究对象，通过一个次壳层突变D124G，将2-氟腺苷的合成收率从11%提高到91%，并拓展至多种具有药物价值的核苷类似物。相关成果于近日在线发表于Organic Letters。

从底物进入口袋到形成可反应构象

酶工程中常见的做法是直接改造与底物接触的第一壳层残基，以扩大结合口袋或改变底物识别。但第一壳层通常同时承担催化和定位功能，改动过大容易损伤原有催化网络。次壳层残基不直接参与成键或断键，却可以通过局部堆积、氢键环境和构象动力学影响活性中心。研究团队由此提出，核苷磷酸化酶工程的限制因素可能不是底物能否进入，而是进入后有多少酶-底物复合物真正处于可反应状态。

核苷磷酸化酶HpnG参与细菌霍烷化合物的生物合成，是一种具有特殊天然功能背景的嘌呤核苷磷酸化酶。它对多种核苷底物表现出磷解活性，但其对非天然核碱基受体的合成能力此前并未得到系统开发。团队以HpnG作为验证体系，通过次壳层工程，在不替换保守催化残基的情况下，提高糖磷酸供体和核碱基受体形成近攻击构象的概率。

图1. HpnG在霍烷类化合物生物合成中的天然反应，以及本研究提出的次壳层预组织模型。D124G并非直接参与成键，而是提高供体和受体形成生产性构象的概率。（图片来源：Organic Letters）

一个次壳层位点带来显著活性提升

研究以肌苷和2-氟腺嘌呤合成2-氟腺苷为模型反应。研究人员首先考察了M18、M142和L172等靠近底物口袋的位点，但这些突变没有带来明显改善。随后，团队将注意力转向位于活性中心后方相邻螺旋上的D124。该残基属于次壳层，不直接取代催化残基，却可能调节活性中心的局部组织状态。在D124G、D124A、D124S、D124N、D124P和D124E等变体中，D124G表现最突出，将2-氟腺苷收率由野生型的11%提高到91%。将D124G与初筛中的其他突变组合也没有进一步提升，说明关键变化并不是简单扩大口袋。

动力学实验进一步显示，D124G主要改变了催化周转，而没有显著降低肌苷的表观Km。在不加入2-氟腺嘌呤时，D124G与野生型对肌苷的表观Km分别为52.5和44.9 mM，差异有限；表观kcat则从0.30 min⁻¹提高到31.1 min⁻¹，增幅超过100倍。在加入2-氟腺嘌呤后，D124G的表观kcat进一步达到70.5 min⁻¹。需要指出的是，这组参数通过次黄嘌呤形成量得到，描述的是肌苷磷解过程，不能直接视为完整转糖基化反应的稳态动力学常数。

图2. HpnG的结构指导突变筛选。D124位于活性中心附近的次壳层，D124G使2-氟腺苷收率由11%提高到91%。（图片来源：Organic Letters）

从模型反应拓展到药物相关核苷

D124G的作用并不局限于2-氟腺苷。以肌苷作为核糖供体时，该变体能够接受多种嘌呤型核碱基，获得P1至P7。对于野生型难以高效转化的底物，提升尤其明显。例如，含碘核苷P4的收率由5%提高到80%，同时为后续衍生化保留了可利用的卤素位点。

更换糖供体后，HpnG-D124G仍保持了较宽的合成范围。以2'-脱氧肌苷为供体，可获得P8至P14，其中抗白血病药物克拉屈滨的收率为75%，野生型仅为12%。以阿糖腺苷为阿拉伯糖供体，还可合成氟达拉滨和奈拉滨。研究同时给出了方法边界：在所测试条件下，尝试进行C-糖基化时没有得到目标C-核苷，而是形成了相应的N-糖基化产物。因此，现阶段的证据支持该酶对多种嘌呤型受体和三类糖供体的适用性，但不能外推到所有碱基类型或C-糖基化反应。

图3. HpnG-D124G催化的核苷转糖基化底物谱。该变体可利用核糖、2'-脱氧核糖和阿拉伯糖供体，合成多种嘌呤核苷类似物。（图片来源：Organic Letters）

D124G如何改变生产性预组织

为了理解远离成键中心的D124G为何能显著提高反应效率，团队分析了野生型和D124G分别与核糖-1-磷酸及2-氟腺嘌呤形成的三元复合物。每种酶完成3条独立的100 ns分子动力学轨迹，总采样时间为300 ns。分析同时考察供体异头碳C1'与受体N9之间的距离，以及N9-C1'-O4'近攻击角。只有距离和角度同时满足条件，才被定义为生产性构象。

按这一联合判据，D124G轨迹中生产性构象占4.1%，野生型为1.3%，提高约3.2倍。放宽距离阈值后仍得到相同趋势。这个结果并不意味着突变体把底物锁定在单一姿态，而是说明它提高了体系反复进入可反应构象的机会。接触分析也显示，D124G有利于核碱基受体和糖磷酸供体形成更协调的相互作用网络。

研究人员进一步从D124G富集的近攻击构象出发，进行蛋白点电荷嵌入的约束电子结构扫描。在受体N9逐渐靠近C1'、离去键C1'-O1P逐渐拉长的过程中，近攻击角保持在约105至106度。该计算支持这一预组织构象沿预期耦合坐标继续演化的几何可行性。

图4. D124G对供体-受体生产性预组织的影响。分子动力学结果显示D124G富集同时满足距离和近攻击角条件的构象；约束电子结构扫描用于检验该构象沿预期反应坐标演化的几何可行性。（图片来源：Organic Letters）

总结

这项工作将核苷磷酸化酶工程中的两个概念区分开来：酶能够容纳一种底物，并不意味着底物会以适合成键的方式被容纳。HpnG野生型具有潜在的底物耐受性，而D124G通过改变活性中心构象群体，提高供体和受体同时接近并正确取向的概率。实验结果体现为更快的肌苷磷解周转和更广的核苷合成范围，计算结果则为生产性预组织模型提供了受证据边界约束的结构解释。对酶工程而言，这提示次壳层位点可作为一类值得系统考察的设计对象，尤其适用于直接改动第一壳层可能破坏保守催化网络的体系。该研究为未来酶的活性设计和理性改造提供新的策略和思路。

江西师范大学化学与材料学院博士研究生刘许雪为本文第一作者。张琪和泰国苏兰拉大学赖荣亿教授为本文通讯作者。

论文信息

论文题目：A Second-Shell Mutation Preorganizes HpnG for Broad-Scope Nucleoside Transglycosylation

作者：Xuxue Liu, Deshuai Yang, Rung-Yi Lai, and Qi Zhang

期刊：Organic Letters

上线日期：2026年9月2日

DOI：10.1021/acs.orglett.6c03331

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