Adv Sci | 邵世鹏/张宏晨合作开发一种紧凑型高保真RNA成像平台—CDegSR在RNA单分子成像领域取得重要进展

活细胞中 RNA 的动态变化是基因表达调控的关键环节，然而，传统成像策略长期受制于技术瓶颈 ， 荧光蛋白类探针因背景干扰强、信噪比低，难以实现对单个 RNA 分子的清晰识别；而以 CRISPR-Cas13 为代表的可编程工具虽具优势，但其效应蛋白分子量过大（约 130–150 kDa ），不仅对靶标 RNA 产生显著的空间阻碍，也因载体容量限制 而难以经由 腺相关 病毒等小型递送系统高效转入细胞。因此，在不显著扰动靶分子前提下实现内源 RNA 的高灵敏度、单分子级可视化，始终是该领域悬而未决的核心科学挑战。

针对上述 难题 ， 西南大学 生命科学 学院 含 弘研究员张宏晨与 重庆医科大学 基础医学院邵世鹏教授团队 合作 ， 在Advanced Science期刊发表题为Single-Molecule Imaging of Endogenous RNA UsingaMiniaturizedand Circularly Permuted CRISPR-Cas13Degron-Masking SystemCDegSR的研究文章。从蛋白质结构工程入手成功开发了一种紧凑型高保真RNA成像平台—CDegSR（ CRISPR-mediated Degron -based Signal Restoration ）（图1），通过融合蛋白质工程改造与条件性蛋白稳定性调控策略，在活细胞中实现了对内源性RNA的高信噪比单分子实时追踪，为解析基因表达的时空动态规律提供了有力的工具支撑。

图 1 ：高保真 RNA 成像平台 — CDegSR （ CRISPR-mediated Degron -based Signal Restoration

基于冷冻电镜解析的 PspCas13b-crRNA-tgRNA 三元复合物结构， 研究者 有选择性地去除 HEPN1 与 HEPN2 两个 核酸酶结构域，将效应蛋白压缩至仅 含核心识别 区（ REC lobe ）的约 70 kDa 微型版本，命名为 miniCas13 。该设计不仅使蛋白尺寸缩减至原有的一半，也有效削弱了其对 RNA 靶点的位阻效应 ，并提升了成像的持续稳定性。 然而，精简后的 miniCas13 仍为 “ 常亮型 ” 荧光蛋白， 溶液中游离的未结合效应器会持续产生非特异性背景。 为此， 研究团队引入 环状排列（ Circular Permutation ） 策略，将蛋白的天然末端通过柔性连接子融合， 并在靠近 RNA 结合界面的第 423 位氨基酸处 开辟新的末端。在此基础上，在新末端融合了富含精氨酸的降解信号（ RRRG degron ）， 使得未结合靶标的 miniCas13 被蛋白酶 体快速 清除，而一旦结合 RNA ，该降解信号 因空间 位阻被遮挡，蛋白随之稳定存留。这种 “ 结合即稳定 ” 的智能调控机制，最终赋予 CDegSR 近二十倍的荧光诱导倍数，其信噪比远优于传统 dCas13 系统。

在单分子成像应用层面， 团队靶向 POLR2A （ RNA 聚合酶 II 最大亚基） mRNA ，设计了 24 条 crRNA 组合，并通过慢病毒文库高效 共递送，实现单个 mRNA 分子上多价 CDegSR 效应器的协同招募， 从而突破衍射极限，达到单分子分辨能力。 正交验证 结果显示 ， CDegSR 标记的荧光 puncta 与单分子 RNA 荧光原位杂交（ smFISH ）信号高度共定位，皮尔逊相关系数达 0.77 ，假阳性率和假阴性率均低于 10% ，且标记本身不改变目标 RNA 的表达丰度与周转速率。研究团队还成功将该技术应用于多种 RNA 类型的成像，包括 NEAT1 、 7SK 、 SatIII 以及表达丰度极低（ nTPM =5.2 ）的 ZNF530 mRNA ，充分证明了 CDegSR 系统的普适性与灵敏度。

利用 CDegSR 平台，研究团队 实现了对活细胞中 POLR2A mRNA 的高频单分子示踪， 定量揭示了细胞核与细胞质之间 mRNA 扩散行为的显著差异。核内 mRNA 呈现亚扩散或受限迁移特征，暗示染色质结构、核体及蛋白网络所形成的密集核环境对转录 本形成 物理束缚；而胞质中的 mRNA 则扩散更为自由。进一步实验表明，当使用嘌呤霉素阻断翻译后， mRNA 的跳跃距离、扩散系数、异常扩散标度指数及分形维数均发生明显变化，提示翻译机器本身也参与调节 mRNA 的胞质扩散行为。这一发现为深入理解 mRNA 在细胞质中的命运调控机制提供了崭新的视角。

原文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.77533

制版人：十一

学术合作组织

（*排名不分先后）

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