广东省中医院中医证候国家重点实验室揭示中药成分狼牙菜苷通过线粒体重塑和减少破骨细胞生成中ROS产生改善类风湿性关节炎相关骨破坏

【写在前面】：本期推荐的是由广州中医药大学第二临床学院中医证候国家重点实验室（广东省中医院）、广东省中医证候临床研究重点实验室、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）中医湿热证国家重点实验室等研究团队合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，揭示狼牙菜苷通过靶向Stat2-Drp1依赖的线粒体重塑和减少破骨细胞生成中ROS的产生来改善类风湿性关节炎相关的骨破坏。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Sweroside ameliorates rheumatoid arthritis-associated bone destruction by targeting Stat2-Drp1-dependent mitochondrial remodeling and reducing ROS production in osteoclastogenesis

背景

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是持续的滑膜炎症和进行性骨侵蚀。过度破骨细胞生成是导致RA相关骨破坏的核心病理事件。狼牙菜苷Sweroside是一种具有生物活性的环烯醚萜苷，已被报道具有抗炎和细胞保护作用，但其对炎性骨溶解的治疗潜力及其直接分子靶点尚不清楚。

目的

本研究旨在考察Sweroside是否可以预防RA相关的骨破坏，并确定其直接分子靶点和潜在机制，特别关注破骨细胞生成、线粒体重塑、代谢重编程和氧化还原稳态。

方法

通过关节炎评分、组织病理学评估、微型计算机断层扫描、TRAP染色、免疫组织化学和蛋白质印迹评估胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠的治疗效果。在体外，RANKL刺激的BMM用于评估破骨细胞分化、F-actin环形成、骨吸收、ROS产生、线粒体生物合成、线粒体膜电位、ATP产生和代谢重编程。使用。

结果

Sweroside显著改善了CIA大鼠的关节炎严重程度、滑膜炎症、软骨破坏和骨侵蚀，同时减少了破骨细胞的积聚和体内Stat2-Drp1信号的抑制。在RANKL刺激的BMM中，sweroside剂量依赖性地抑制破骨细胞形成、F-actin环组装和骨再吸收活性，在破骨细胞分化的早期阶段观察到最明显的作用。Sweroside还通过激活Nrf2-Keap1抗氧化途径降低了细胞内和线粒体ROS水平。同时，sweroside抑制线粒体生物合成和代谢重编程，这反映在线粒体质量、线粒体膜电位、mtDNA拷贝数、ATP产生、氧化磷酸化和糖酵解活性的降低上。靶标鉴定和验证表明，Stat2是sweroside的直接结合靶标。从机制上讲，sweroside破坏了Stat2和Drp1之间的相互作用，降低了Stat2的表达和磷酸化，抑制了Drp1在Ser616的磷酸化，并减弱了下游NF-κB的激活。此外，Stat2沉默增强了sweroside的抗破骨细胞生成作用，而Stat2或磷酸化Drp1的过表达部分逆转了这种作用。

结论

Sweroside通过直接靶向Stat2改善RA相关的骨破坏，从而抑制Stat2-Drp1依赖的线粒体重塑、代谢重编程和氧化应激。这些发现支持sweroside作为RA和其他炎性骨破坏性疾病的有前景的植物治疗候选药物。

图文摘要

Sweroside是一种具有生物活性的环烯醚萜苷，直接结合Stat2并发挥双重氧化还原调节作用，以抑制类风湿性关节炎中病理性破骨细胞的生成。通过Stat2-Drp1微软骨代谢重编程轴，Sweroside抑制Drp1 Ser616D磷酸化，抑制线粒体裂变驱动的代谢适应，减少ROS产生和ATP输出，并阻断下游NF-κB活化。同时，Sweroside激活Nrf2-Keap1抗氧化途径，增强细胞内ROS清除。这种协调机制抑制破骨细胞分化和骨吸收功能，最终改善胶原诱导的关节炎中的炎症性骨破坏。

【前言】

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其特征是持续性滑膜炎、软骨破坏和渐进性关节周围骨侵蚀，最终导致关节畸形和长期功能残疾。流行病学数据表明，RA影响全球约0.5-1%的成年人口，其患病率随着人口老龄化而持续上升，造成了巨大的社会经济负担。在RA的结构表现中，骨侵蚀尤其有害，因为它通常在疾病过程的早期发展，并与关节结构和功能的不可逆损伤密切相关。尽管抗风湿治疗取得了重大进展，但即使在炎症明显改善的情况下，很大一部分患者的结构性骨损伤仍未得到充分控制。这一临床观察强调，需要更好地了解驱动RA破骨细胞介导的骨破坏的细胞和分子机制，并确定骨骼保护的药理学可操作靶点。

狼牙菜苷Sweroside是一种主要从龙胆属和獐牙菜属植物中分离出来的裂环烯醚萜苷，据报道具有抗炎、抗氧化和细胞保护活性。在之前的研究中，Sweroside被证明可以抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，并在绝经后骨质疏松症环境中促进破骨细胞凋亡，主要是通过调节NF-κB和MAPK通路。这些发现证实了Sweroside的基本抗破骨细胞生成活性。然而，Sweroside是否可以改善RA相关的炎症性骨破坏，更重要的是，它是否通过将破骨细胞生成与线粒体重塑和氧化还原控制联系起来的直接分子靶点起作用，尚未得到阐明。因此，本研究的目的不是简单地重新确认Sweroside的一般抗破骨细胞表型，而是将其研究扩展到炎性关节炎的背景下，并确定其骨保护作用的靶点中心机制。

在这里，我们使用胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型和RANKL诱导的骨髓源性巨噬细胞（BMMs）破骨细胞生成，表明Sweroside在体内减轻了炎症性骨破坏，在体外抑制了破骨细胞分化和再吸收功能。从机制上讲，Sweroside减少了细胞内ROS和线粒体ROS的积累，激活了Nrf2-Keap1抗氧化途径，并显著抑制了破骨细胞生成过程中的线粒体生物发生和生物能量重塑。为了确定导致这些效应的直接靶点，我们整合了4D DIA定量蛋白质组学、DARTS-LC-MS/MS、CETSA、表面等离子体共振（SPR）、分子对接、分子动力学模拟和功能获得/丧失救援实验。该策略将Stat2确定为Sweroside的直接结合和功能靶点。我们进一步证明，Sweroside抑制Stat2-Drp1信号轴，从而抑制线粒体重塑、代谢重编程和氧化还原依赖性破骨细胞分化。总的来说，这项研究扩展了我们之前的表型观察，并提供了机制证据，表明Stat2-Drp1微软骨代谢轴在破骨细胞介导的炎性骨破坏中是一种药理学上可处理的脆弱性。这些发现不仅阐明了Sweroside在RA相关骨溶解中作用的分子基础，还强调了Stat2作为线粒体和氧化还原导向干预炎症性骨病的潜在治疗靶点。

【结果部分】

1.Sweroside抑制体外破骨细胞分化。

A：Sweroside 化学结构（secoiridoid 苷类）。
B：CCK-8 检测 0 至 50 μM Sweroside 对 BMM 增殖的影响。
C、E：不同浓度下 TRAP 阳性多核细胞定量与代表图。
D、F：同一浓度分别在 day 1–3、day 3–5、day 5–7 给药的 TRAP 定量与代表图。
G：罗丹明鬼笔环肽标记 F-actin 环，定量封闭面积与每环核数。
H：羟基磷灰石板骨吸收陷窝面积定量。

2.Sweroside激活Nrf2-Keap1通路以抑制ROS的产生。

A：DCFH-DA 胞内 ROS 荧光代表图与定量。
B：同探针流式直方图与 MFI 定量。
C：MitoSOX 线粒体 ROS 荧光成像代表图与定量。
D：Nrf2、Keap1、Catalase、HO-1、SOD1、SOD2 蛋白印迹与定量。

3.Sweroside在破骨细胞发生过程中调节线粒体代谢重编程。

A：4D DIA 蛋白组差异蛋白柱状图。
B–D：GO 富集分析。
E：KEGG 通路气泡图（下调蛋白）。
F：MitoTracker Green 流式定量线粒体质量。
G：MitoTracker Red 共聚焦成像。
H：JC-1 膜电位荧光代表图。
I：透射电镜线粒体超微结构代表图。
J：mtDNA 与核 DNA 比值定量。
K：ATP 产量定量。
L：线粒体 ROS 荧光成像与定量。

4.Sweroside减弱了与破骨细胞生成相关的代谢重编程。

A：Seahorse OCR 实时轨迹（序贯注射 oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin A）。
B：OCR 四项参数定量（基础呼吸、ATP 关联呼吸、最大呼吸、备用呼吸容量）。
C：ECAR 实时轨迹。
D：ECAR 糖酵解参数定量。

5.Stat2被确定为Sweroside的潜在分子靶标。

A：DARTS-LC-MS/MS 流程示意。
B：不同 Pronase 浓度优化的 SDS-PAGE。
C：1:300 Pronase 条件下正式 DARTS 的 SDS-PAGE。
D：差异蛋白层级聚类热图。
E：差异蛋白火山图。
F：前 8 个候选靶蛋白汇总表。
G：Stat2 与 Sweroside 的分子对接模式。

6.Stat2是Sweroside的直接靶蛋白。

A：CETSA 流程示意。
B、C：DMSO 对照与 Sweroside 组的 CETSA 蛋白印迹与定量。
D：DARTS-WB 在不同 Pronase 浓度下 Stat2 的抗降解性。
E：DARTS-WB 在不同 Sweroside 浓度下 Stat2 的抗降解性。
F、G：SPR 传感图与 Ka、Kd、KD 动力学参数。

7.Stat2作为Sweroside的功能介质。

A：siRNA 转染后 BMM 增殖的 CCK-8 检测。
B：三条 siRNA 沉默效率的 RT-PCR 检测。
C：对应蛋白水平的蛋白印迹。
D：TRAP 染色与定量。
E：F-actin 环与 NFATc1 核转位的免疫荧光检测。
F：p-Stat2、p-Drp1-S616D、p-P65 等下游蛋白印迹。

8.Stat2-Drp1通路的过表达逆转了Sweroside的抗破骨细胞作用。

A：Stat2 与 Drp1-S616D 过表达的蛋白印迹验证。
B：对应 RT-PCR 验证。
C：TRAP、F-actin 环、ROS、线粒体 ROS、膜电位综合面板（空载体、过表达 Stat2、过表达 Drp1-S616D 三组）。

9.Sweroside抑制破骨细胞生成过程中Stat2-Drp1信号通路的激活。

A：Stat2、p-Stat2、Drp1、p-Drp1(S616) 蛋白印迹。
B：p-Stat2 免疫荧光定量。
C：空载体、过表达 Stat2、过表达 Drp1-S616D 三组的总蛋白与磷酸化对照印迹。
D：免疫共沉淀（用 Drp1 抗体拉下，Stat2 抗体检测）评估复合物形成。
E：Stat2 与 Drp1 共定位免疫荧光代表图及荧光强度分布分析。

10.Sweroside可减轻CIA大鼠踝关节病理损伤和炎症浸润。

A：CIA 模型建立与给药流程示意。
B：关节炎评分。
C：足爪外观代表图。
D：体重变化曲线。
E：血清 IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP、RF 的 ELISA 定量。
F、G：踝关节 H&E 代表图与病理评分。

11.Sweroside减轻CIA大鼠关节炎的严重程度。

A：踝关节番红 O 固绿染色代表图。
B：踝关节 TRAP 染色代表图。
C：Micro-CT 三维重建代表图。
D：BMD 定量。
E：BS/TV、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N 定量。

12.Sweroside通过Stat2-Drp1信号通路改善关节炎进展。

【结论与讨论】

总之，本研究将Sweroside确定为一种天然化合物，通过直接靶向Stat2并抑制Stat2-Drp1微软骨代谢重编程轴，同时激活Nrf2依赖性抗氧化防御，从而减轻病理性破骨细胞分化和RA相关的骨破坏。除了证明Sweroside的药理活性外，我们的研究结果还强调了Stat2作为破骨细胞介导的骨破坏潜在靶点的概念和治疗新颖性。这些结果为Stat2导向和线粒体中心的RA和相关溶骨性疾病治疗策略的发展提供了机制支持。

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