靶向FOXM1/CEBPB轴驱动的细胞状态可塑性，可破坏肝细胞癌的发育异质性及治疗抵抗

研究背景

肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要形式，也是全球癌症相关死亡的第四大原因。尽管手术和局部治疗已被广泛应用，但大多数患者最终仍需要系统治疗。只有一小部分患者对治疗有应答，但最终会产生耐药性。越来越多的证据支持HCC中存在癌症干细胞样亚群，突显了疾病进展过程中发育调控程序的重要性。表型可塑性诱导的异质性细胞状态跨越了发育层级，并成为HCC治疗抵抗的关键驱动因素。然而，控制这种发育异质性的因素尚不清楚，且缺乏治疗干预手段。近期《Journal of Hepatology》发表的一项研究，确定FOXM1是细胞状态可塑性和肿瘤发育异质性的潜在驱动因子。抑制FOXM1恢复了肿瘤发育同质性，并使肿瘤细胞重新对治疗药物敏感1。

研究设计

对HCC患者的批量RNA测序和单细胞RNA测序公共数据集，以及肝细胞分化模型进行自调节网络分析，以识别在肝脏分化过程中控制细胞状态转换的关键转录调控因子。使用体外和体内模型来研究分子机制并评估治疗潜力。

研究结果

HCC中的发育异质性

研究显示，癌胎干细胞（OSC）亚群与胚胎干细胞程序密切相关。肝脏祖细胞样（LP）亚群强烈表达肝脏祖细胞标志物CD24和CK19。未成熟肝细胞（PH）亚群对甲胎蛋白（AFP）和GPC3呈阳性，这两种标志物通常出现在早期胎儿肝脏中。肝细胞样细胞（HLC I/II/III）代表肝细胞成熟前的过渡状态。不同肿瘤亚群的基因表达模式与肝分化过程吻合良好。拟时序分析和CytoTRACE分析也证实，OSC/LP中大部分特征基因聚集在肝脏发育的早期阶段，而PH/HLC中的特征基因则富集在肝脏发育的晚期阶段。RNA速率分析揭示了混乱的细胞状态转换同时发生在大多数HCC患者中。使用多色免疫荧光染色也证实了从OSC/LP到PH/HLC具有不同分化状态的细胞层级在HCC组织中聚集成簇。

发育异质性肿瘤与治疗抵抗和不良临床结局相关

本研究发现大多数HLC和LP亚群属于促免疫类，而剩余的OSC和PH亚群被归类为预排斥类。尽管LP亚群被归类为促免疫类，但它表现出耗竭表型，高表达如PD-L1、TGFB1和B7-H3/4等免疫抑制分子。这些发现进一步强调了细胞组成和发育状态在决定免疫微环境和治疗反应中的重要性。此外，研究发现，干扰发育异质性可能会影响具有高遗传异质性的HCC患者的临床结局。

肝分化的系统性自调节网络揭示控制肿瘤细胞状态转换和可塑性的主要转录调控因子

在肝细胞分化模型中使用FOXM1特异性抑制剂FDI-6处理每个分化阶段的细胞，进行了约束性解卷积分析，结果表明，FDI-6在所有被检查的阶段都驱动细胞向更高级的发育状态发展。在整个肝脏发育过程中发现了FOXM1和CEBPB的互斥表达模式。对公开的人类肝脏发育scRNA-seq数据进行的拟时序分析也揭示了类似的表达模式。综上所述，这些结果进一步证明FOXM1和CEBPB的相互调控对于协调肝脏谱系定向过程中的细胞状态转换至关重要。

FOXM1和CEBPB直接相互抑制对方的转录

对来自HCC scRNA-seq数据（PRJCA007744）的恶性细胞沿发育拟时序进行的伪批量相关分析显示FOXM1和CEBPB表达之间存在显著的负相关性。荧光素酶报告基因检测进一步证实，沉默FOXM1或CEBPB均可导致对方的转录激活，而当删除启动子区域的DNA结合区域时，这些效应被消除。通过在Huh7细胞中进行的RNA-seq检测，FDI-6处理诱导了与细胞周期调控相关的FOXM1靶基因的广泛抑制，以及免疫调节基因的同时激活。这些发现表明，FOXM1和CEBPB可以以相互抑制的方式调节对方的转录，并可以竞争性控制其下游靶点的转录。

抑制FOXM1破坏肿瘤发育异质性

来自同一患者建立的HCC来源类器官（PDOs），经FDI-6处理指定时长后，监测其球体生长情况。结果显示，FOXM1抑制可下调多个肝分化亚群中代表性标志物的表达。相应地，FDI-6治疗后肝终末分化标志物的表达显著增加。在肝癌细胞系中敲低FOXM1表达或用FDI-6药理学抑制FOXM1时，观察到类似的发现。免疫组织化学（IHC）染色进一步证实，FOXM1抑制可使HCC PDOs从高表达多阶段分化标志物的未分化球体，转变为成熟肝样球体。

破坏发育异质性使HCC细胞对靶向治疗和免疫治疗敏感

为了评估FOXM1抑制与免疫检查点抑制剂联合使用的治疗效果，对携带皮下H22 HCC肿瘤的免疫正常BALB/c小鼠单独使用FDI-6或联合抗PD-1抗体治疗。免疫荧光染色显示，在用FDI-6处理的小鼠肿瘤中，CD8+细胞毒性T细胞的浸润显著增加。虽然抗PD-1抗体或单独抑制FOXM1可以抑制BALB/c小鼠的肿瘤生长，但两者联合使用产生了显著更大的治疗效力。IHC染色进一步证实，抑制FOXM1显著增加了肿瘤核心区域CD8+T细胞的浸润，并且在联合抗PD-1治疗时增强。

抑制FOXM1激活肿瘤细胞促炎信号传导

在用FDI-6处理4天的Huh7细胞的RNA-seq数据上，对免疫特征通路进行了基因集富集分析（GSEA）。在FOXM1抑制后，检测到IFN-γ相关通路、MHC I类复合物和免疫反应的显著富集。与细胞系中的发现类似，在FOXM1抑制后，PDX异种移植肿瘤中发现了免疫反应通路的显著富集。研究证实了在FOXM1抑制后，细胞成分从免疫冷亚群（OSC和PH）向热亚群（HLC）的转变。炎症信号的强度沿着拟时序轨迹向HLC状态增加。此外，药物治疗后，HLC中代表性促炎通路的GSVA评分进一步增加。在FOXM1抑制后，HCC细胞中响应IFN-γ处理的IFNGR1下游分子也证实了强烈的增加。这些发现表明，抑制FOXM1可能增强HCC细胞感知IFN-γ的能力，并可能将肿瘤重塑为促炎状态。

抑制FOXM1通过抑制EZH2恢复肿瘤细胞抗原呈递

在EZH2（一种与抑制性组蛋白标记密切相关的表观遗传修饰因子）的启动子区域鉴定出FOXM1的预测结合峰。通过ChIP-qPCR进一步证实了FOXM1与EZH2启动子的结合。抑制FOXM1抑制了EZH2的表达和蛋白质丰度。在来自HCC患者多个scRNA-seq数据集和TCGA-LIHC批量RNA-seq数据集的恶性细胞中也发现了FOXM1与EZH2表达之间的强正相关关系。蛋白质印迹和流式细胞术检测均显示，FOXM1过表达抑制了MHC-I分子，而当抑制EZH2活性时，这种效应被消除。

靶向肝脏FOXM1的RNAi类治疗药物的构建与筛选

对靶向FOXM1的所有候选siRNA的引导链进行了全基因组匹配筛选，并合成了20对高特异性的siRNA寡核苷酸进行实验验证。片段si-003因其更优的性能被选中，其半抑制浓度（IC50）为78 pM。采用化学修饰以提供核酸酶抗性并减弱内源性免疫传感器的激活。通过qPCR检查了si-003化学修饰后的基因沉默效果，并通过蛋白质印迹进一步证实。研究进一步检测了靶向抑制的效率，以确定GalNAc偶联寡核苷酸的最佳硫代磷酸修饰。采用双荧光素酶报告基因实验，通过检测含si-003片段全长匹配序列或种子区匹配序列的报告质粒的荧光素酶活性，评估种子区介导的脱靶效应。选择先导化合物GalNAc-siFOXM1-003（GalF-003）进行进一步评估。

靶向FOXM1的RNAi治疗在小鼠模型中显示出高效力和良好耐受性

携带原位肝肿瘤的小鼠通过静脉注射给予偶联的siRNA药物或载体对照，剂量递增，每隔一周一次。与载体处理相比，GalF-003治疗以剂量依赖的方式显著抑制了肿瘤生长。药物治疗导致肿瘤体积、重量和Foxm1蛋白丰度降低，同时肿瘤中CD8+细胞毒性T细胞的浸润显著增加。在大多数HCC病例中发现了ASGR1的阳性染色。当使用PDX91的染色作为截止值时，大约70%的HCC患者高于基线，表明大多数患者可能受益于RNAi类治疗药物。

目前的癌症疗法主要针对单一致癌通路或免疫检查点，但低估了肿瘤细胞的高度可塑性和相关的发育异质性。靶向肿瘤内异质性已被提出作为克服这些临床困难的新策略。本研究提出靶向肿瘤细胞状态可塑性作为克服HCC治疗抵抗的突破点。这不仅是因为分散且不可逆的遗传异质性难以靶向，更重要的是，因为临床证据表明，无论遗传背景如何，发育异质性是患者预后的强预测指标。

选择RNAi类的小核酸药物作为治疗方式。与经典的小分子抑制剂相比，RNAi类药物具有许多潜在优势，包括可向靶器官实现特异性递送、能够抑制传统不可成药靶点，以及具备体内作用的持久性。考虑到FOXM1在某些活跃增殖组织中的基础表达，使用FOXM1抑制剂进行全身治疗可能给患者带来不可预测的风险。

研究结论

FOXM1/CEBPB轴驱动的肿瘤细胞状态可塑性诱导了肝细胞癌中的发育异质性和治疗抵抗。靶向肝脏FOXM1的RNA干扰治疗具备开展进一步临床试验的巨大潜力。

参考文献

1. Zhang XF, et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2026 Feb;84(2):370-384.

审批编号：CN-190795

有效期至：2027-08-05

本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考。

撰写：Atopos

审核：Chiu

排版：Aurora

执行：Atai

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