Cell Rep | 陈波/谢烨团队揭示成年哺乳动物中视网膜原位再生的新机制

成年 哺乳动物中枢神经系统缺乏自我修复的能力。因此，退行性疾病（阿尔兹海默病、 帕金森病、 青光眼 、视网膜黄斑变性 等）往往伴随着神经元死亡，引发不可逆功能衰退。运用在体细胞重编程技术将胶质细胞原位转变为神经 元 ，为 该类疾病的 治疗提供了新策略。尤其，通过 AAV 基因 治疗 工具在体内调控 单 基因表达水平（比如 ： 敲低 Ptpb1 或过表达 NeuroD1 ） ，可 将 大脑或视网膜中的 胶质细胞 直接转分化为神经元，被誉为再生医学领域的 “ 圣杯 ” 。 然而 ，后续一系列研究运用遗传谱系示踪技术 揭示 出 上述 “ 再生神经元 ” 很 可能是 由于 AAV 泄漏到内源已存在神经元而造成的 “ 实验假象 ” ，引发该领域巨大讨论。其中， 遗传谱系示踪是否可用于检验 “ 胶质细胞向神经元真正的细胞命运转变 ” 尚存争议。

近日，四川大学华西医院 视觉神经生物学及转化医学研究所陈波教授 、 同济大学生命科学与技术学院 及 附属第十人民 医院双聘 研究员谢烨， 与 中 美多家单位研究人员 合作 ，在 Cell Reports 期刊在线发表了题为 Reprogramming lineage-traced Müller glia for robust proliferation and neurogenesis in adult mammalian retinas 的 研究 论文。 该研究 借鉴再生物种斑马鱼视网膜中 天然存在的“ Müller 胶质细胞 在体重编程 ” 过程，运用 特异性 靶向 Müller 胶质细胞 的谱系示踪工具鼠 、 高效 编辑其细胞命运 的 AAV 递送载体，结合细胞周期化学标记、 关键 信号途径解析、 单细胞转录组测序与拟时序分析等， 开发“ FGF2/ASCL1/Retinoic acid (FAR) ”联合处理的“两步重编程”策略， 在成年小鼠眼内成功将 Müller 胶质细胞 先去分化为具备强健增殖能力的干 / 祖样细胞 （ Müller glia-derived progenitor-like cells, MGPLCs ） ，再进一步向视杆（ rod-like ）、双极（ bipolar-like ）和无长突（ amacrine-like ）样神经细胞 分化， 实现 视网膜 部分 原位 再生 。

1 、成纤维生长因子 FGF2 与神经前体基因 ASCL1 协同 促进 Müller 胶质细胞 产生 强健细胞分裂

之前的研究表明 仅表达 神经前体基因 ASCL1 不足以实现 Müller 胶质细胞 在体重编程 为视网膜神经元 。该研究中作者首先运用高效靶向 Müller 胶质细胞 的 AAV 载体向 谱系示踪 成年小鼠（ 2-3 个月）眼内递送 表达 ASCL1 ， 使其 转 染 Müller 胶质细胞 的效率达到近 90% 。之后， 向 视网膜中再次注射 FGF2 ，使 Müller 胶质 细胞 重新进入细胞周期， 并 被不同细胞周期标志物 （ EdU 、 Ki67 、 PH3 ） 标记与示踪，产生 遍及整个视网膜的 大量细胞增殖。 同时， FGF2/ASCL1 处理后 Müller 胶质细胞 展现出 类似于 视网膜祖细胞在 正常 发育过程中的细胞行为；利用 EdU 和 BrdU 进行细胞周期 S 期双 化学标记与 示踪，检测到部分细胞甚至产生两轮细胞分裂。这些 结果 提 示 FGF2/ASCL1 可能促进了 Müller 胶质细胞 去分化为内源性干 / 祖样细胞 ，具备了 极强的 自我更新能力。

2 、 MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 信号途径介导了 FGF2 对 Müller 胶质细胞 的促分裂作用

作者检测了 FGF2 在细胞内激活的相关信号途径。发现 Müller 胶质细胞 中 Erk 和 Akt 及其下游蛋白的磷酸化水平在眼内注射 FGF2 后显著上调 ，暗示 MAPK/Erk 和 PI3K/Akt 这两条信号途径被激活 ；同时，使用 这两条信号途径 抑制剂 U0126 或 LY294002 与 FGF2 共注射， 检测到 FGF2/ASCL1 激活的 Müller 胶质细胞 增殖分别 受 到了大幅度和中等程度抑制 。 此后，将这两条信号 途径 关键 基因 MEK1 和 AKT1 的 组成激活型突变体通过 AAV 载体高效递送到小鼠视网膜 Müller 胶质细胞 。在不注射 FGF2 的情况下， MEK1 S218E/S222D 与 ASCL1 的 AAV 双载体共递送即可 激活 Müller 胶质细胞 轻度增殖；尽管 caAKT1 与 ASCL1 的 共递送 作用不显著，但 与 MEK1 S218E/S222D 一起开展的 AAV 三载体共递送则产生了类似于 FGF2/ASCL1 作用于 Müller 胶质细胞 的强健 增殖 效果 。这些结果表明 MAPK/Erk 和 PI3K/Akt 信号途径介导了 FGF2 对 Müller 胶质细胞 的促分裂作用，其中 MAPK/Erk 起到了主导作用而 PI3K/Akt 也辅助 调控 该过程。

3 、视黄酸可进一步促进 Müller 胶质细胞 衍生细胞表达感光与双极细胞的分子标志物并展现出一定的神经细胞形态

为了观察在体重编程的长期效果，作者在完成 FGF2/ASCL1 注射后 3 个月，检测了 谱系示踪小鼠 Müller 胶质细胞 衍生细胞中表达视网膜神经元分子标志物的情况。发现有 7.7% 、 4.7% 的细胞分别表达了 感光 / 双极细胞的分子标志物 Otx2 和 Crx ，有 约 2% 的细胞表达了无长突 / 视神经节细胞的分子标志物 HuC/D 或 NeuN ，且大部分这些细胞均能够被细胞周期 S 期化学标记。上述结果表明有少部分 Müller 胶质细胞 在经过干 / 祖样细胞的中间态之后最终表达 各 种视网膜神经 元 分子标志物。 有研究报道视黄酸（ Retinoic acid , RA ） 在 组织器官再生修复中发挥 一定 作用。 随后， 作者在 FGF2/ASCL1 基础上再给小鼠注射视黄酸。虽然视黄酸没有进一步增强 Müller 胶质细胞 的增殖能力，却显著增强了其向神经细胞的命运转变。其中， 表达 Otx2 和 Crx 的 细胞 比例分别提 高至 13.5% 与 8.3% ，而表达 HuC/D 和 NeuN 的比例则并没有显著改变。这些结果表明视黄酸 可 促 进 Müller 胶质细胞 向感光 和 双极细胞神经发生。 其中 ，部分 谱系示踪 细胞在表达 Otx2 或 HuC/D 的同时停止表达了胶质细胞的分子标志物 Sox9 ，并位移到视网膜外核层展现出感光细胞形态或位移到底 端 内核层展现出无长突细胞形态。

4 、单细胞转录组测序与 拟时序 分析验证 FAR 处理的 Müller 胶质细胞 最终 往视网膜神经细胞命运方向分化

为了 更全面、系统地 分析 “ FGF2/ASCL1/RA (FAR) ”激活的 Müller 胶质细 胞 在体重编程，作者将不同时间点的 Müller 胶质细胞 衍生细胞进行基于谱系示踪报告荧光蛋白的细胞分选、单细胞转录组测序与分析，检测到 FAR 处理后 Müller 胶质细胞 迅速 丢失了胶质细胞命运， 高表达 Ccnd1 、 Mki67 、 Mcm6 等细胞周期、促细胞分裂相关基因；完成细胞周期后，立即表达了 Btg2 、 Gal 、 Gadd45g 等视网膜神经祖细胞的分子标志物；长期来看，部分细胞 开始 往神经元方向分化，开始表达神经分化 特异 基因 NeuroD1 、 miR124 ，感光 / 双极细胞前体基因 Otx2 、 Crx ， 并 最终往视杆细胞 （ Nrl ） 和双极细胞 （ Pcp2 、 Cabp5 ） 两个亚群分化 。此外，还有一小部分细胞表达了无长突细胞分子标志物 Tfap2b 、视锥细胞分子标志物 Arr3 。拟时序 分析发现 FAR 处理后 产生的干 / 祖样细胞在完成细胞周期后 并没有重新 返回 Müller 胶质细胞 静息状态。 尽管 有约一半细胞 保留了激活性 胶质细胞特性， 但 余下部分则 往视网膜神经元方向再分化 。

5 、小胶质细胞 与神经毒素损伤 参与 调控 FAR 介 导的 Müller 胶质细胞 在体重编程

基因本体富集分析（ Gene Ontology enrichment analysis ） 显示一组炎症相关基因在 Müller 胶质细胞 衍生的干 / 祖样细胞中高表达， 却 在再生神经细胞中表达下调。这一结果暗示炎症反应可能参与调控 FAR 介导的 Müller 胶质细胞 在体重编程。小胶质细胞的激活被认为与视网膜中炎症反应密切相关。 作者运用小胶质细胞抑制剂 PLX3397 在 Müller 胶质细胞 在体重编程不同阶段杀死小胶质细胞， 发现 到 阻断 小胶质细胞介导的炎症反应 虽 适度 抑制重编程过程中 Müller 胶质细 胞 的增殖，却 最终 增强了向多种视网膜神经细胞的分化再生。 这一结果表明免疫微环境可调控 Müller 胶质细胞 在体重编程。

最后，作者检测了损伤条件下 FAR 介导的 Müller 胶质细胞 重编程。 利用 NMDA 神经毒素杀死 部分 无长突细胞和视神经节细胞后， Müller 胶质细胞 的增殖、感光细胞的分化再生 受到 部分抑制，而无长突细胞的最终分化再生却明显增强。 这一结果 表明 FAR 介导的 Müller 胶质细胞 在体重编程 可 通过改变不同 类型神经 细胞的再生比例，对具体的损伤微环境做出 适度应答 。

综上所述，该研究 在 严格谱系示踪 Müller 胶质细胞 的报告基因小鼠 中 运用 “ FAR ” 介 导的“两步重编程”策略， 不仅 成功将成年小鼠视网膜中 Müller 胶质细胞 重编程为内源性干 / 祖样细胞 进而 实现部分视网膜神经细胞的原位再生 ，还 揭示了细胞微环境可调控在体细胞重编程过程， 为“胶质细胞 向 神经元 命运转变 ” 的 机制研究提供了新范式 。 相关团队 将在后续工作中进一步提高神经细胞的 再生效率、增强再生细胞的 生理 功能、丰富再生细胞的种类，为在 体内 定向再生具备完整生理功能的神经元，最终用于治疗多种视网膜退行性疾病提供理论基础与技术途径。

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(26)00933-2?rss=yes

制版人：十一

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