【Org. Lett.】兰州大学雷新响团队：噬菌体展示发现靶向 Cbl-b 的环肽配体

导语

近日，兰州大学雷新响教授团队在Organic Letters发表题为“Discovery of Cbl-b Targeting Cyclic Peptide Ligands by Phage Display”的研究论文。研究团队利用非天然氨基酸O2beY介导的噬菌体展示环肽库，淘选获得了靶向免疫检查点蛋白 Cbl-b 的环肽配体。

研究背景

如何触及Cbl-b 的 “浅表面”？

Cbl-b 是调控免疫细胞活化的重要胞内免疫检查点，其功能依赖 TKB 结构域介导的底物识别和 RING 结构域介导的 E2 招募。与具有深层结合口袋的传统酶靶点不同，Cbl-b 主要通过浅而延展的蛋白–蛋白相互作用界面发挥作用，传统小分子难以实现充分覆盖和选择性结合。尽管 NX-1607、C7683 等化合物已证明 Cbl-b 具有药理可调控性，但直接靶向其底物识别界面的配体仍然有限。环肽具有较大的接触表面积、受限的构象及良好的抗降解能力，因而适合识别此类浅表面。因此，该研究旨在构建结构明确的编码环肽文库，并针对 Cbl-b 开展淘选。

图1 Cbl-b 靶向环肽的研究思路及 O2beY 介导的 MOrPH-PhD 淘选策略。（图片来源：Org. Lett.）

研究策略

通过遗传编码可反应非天然氨基酸（O2beY）构建噬菌体展示环肽库

研究团队借鉴MOrPH-PhD 策略，通过遗传密码扩展将可反应非天然氨基酸 O2beY 引入噬菌体展示肽。O2beY 可与同一肽链中的半胱氨酸发生分子内反应，形成稳定的硫醚环。为确认环化过程真实发生，团队首先构建了 pIII D1–D2 融合模型肽，并通过 MALDI-TOF 质谱观察到与 O2beY-Cys 分子内成环一致的 81 Da 质量差。随后，Biotin-Cys 捕获实验进一步验证了 O2beY 能够在完整噬菌体颗粒表面有效呈现并保留反应活性。基于 pComb3xx 噬菌粒体系，团队构建了CX₇Y* 环肽库用于靶蛋白Cbl-b的环肽配体淘选。

图2 O2beY 介导的噬菌体展示环肽库构建、质谱验证及亲和淘选。（图片来源：Org. Lett.）

靶蛋白Cbl-b亲和淘选锁定结合环肽

研究团队以生物素化Cbl-b 为靶蛋白，对环肽文库进行三轮亲和淘选，噬菌体富集提高约 10⁴ 倍，测序结果也呈现明显的序列收敛。由此获得环大小不同的候选肽RF1和RF2，其与Cbl-b 的 Kd 分别为798 nM 和 1.6 μM，均优于对应线性肽RF-X（2.7 μM），表明宏环化有助于增强靶标识别。竞争 BLI 实验显示，RF1和RF2均可削弱Cbl-b 与 EGFR 来源磷酸化底物肽的结合，提示其可能占据或邻近 TKB 结构域的底物识别区域; 两者对同源蛋白 CBL（RNF55）未显示可检测的结合。与半衰期仅为1.2 h的线性肽相比，RF1和RF2在小鼠血浆中的半衰期分别达到38.5和30.8 h; 在胰蛋白酶降解实验中，RF1和RF2的半衰期分别为9.2 h 和 7.5 h，线性肽则不足 1 h。由此可见，硫醚桥环化不仅改善了靶标结合，也显著增强了肽分子的血浆稳定性和抗蛋白酶降解能力。丙氨酸扫描进一步确定 R4、G5、Y6 和 M7 是 RF1 结合 Cbl-b 的关键残基，对接模型则预测这些残基参与形成连续的界面相互作用网络，但具体结合模式仍需结构实验验证。

图3 Cbl-b 结合环肽的序列、BLI 亲和力及 RF1 预测结合模式。（图片来源：Org. Lett.）

本研究通过噬菌体展示环肽库淘选，得到代表性环肽RF1 具有亚微摩尔亲和力，并表现出底物竞争活性、同源蛋白选择性和良好的稳定性，为 Cbl-b 提供了不同于底物来源磷酸化肽和小分子抑制剂的构象受限配体，为下一步结构优化提供基础。

相关工作发表在Organic Letters（DOI：10.1021/acs.orglett.6c03654）上，兰州大学天然产物化学全国重点实验室博士研究生杨小琴、明巍为本文共同第一作者，雷新响教授、白利文博士后、李开博士为本文通讯作者。上述研究工作得到了本研究得到甘肃省科技重大专项（项目编号：23ZDFA015 和 24ZD13FA017）的资助。

课题组简介

雷新响教授课题组主要从事有机波谱分析和环肽药物化学生物学研究。在核磁共振各向异性参数分析方法上取得若干进展。近年来围绕噬菌体展示肽库的构建与活性环肽发现开展了系统研究，先后将多种化学环化、遗传编码和酶学环化策略引入噬菌体展示平台，并应用于疾病相关蛋白配体的淘选与发现。

作者简介

通讯作者，雷新响，男，博士生导师，药物化学专业，博士。从事基于核磁共振波谱技术的药物分析、天然产物结构鉴定、活性淘选等研究工作。现讲授波谱分析，曾讲授化学生物学、生物化学、结构生物学、药事管理学等课程，主持国家自然科学基金面上项目及国际合作等项目。聚焦于核磁共振(NMR)各向异性参数的分析方法研究，开发了若干实用的液晶定向介质检测方法，在实现NMR各向异性参数 (RDC, RCSA, RQC)构建有机小分子原子分辨率的三维结构方面取得系列成果，已被国内外学者用于复杂天然产物分子的构型确定和挑战的柔性环肽结构的构象分析。近年来开展环肽药物化学生物学研究和药物开发，建立若干杂化噬菌体环肽展示技术用于环肽药物的先导分子淘选。以通讯作者在JACS, Angewandte Chemie International Edition, Science Advances, Chemical Science, Cell Chemical Biology, ACS Nano, ACS Catalysis, Analytical Chemistry, Organic Letters, Chemical Communication等期刊上发表系列论文。申请发明专利6件，任《Natural Products and Bioprospecting》编委；《Magnetic Resonance in Chemistry》国际编委。现任中国化学会有机分析专业委员会委员和中国分析测试协会磁共振分会委员，曾任湖北省药学会理事、湖北省晶体学会理事、浙江省分析测试协会理事，组织了3次国际学术会议和2次全国学术会议，在全国性和国际性学术会议上做报告50余次，被Nature，JACS，ACIE，Nature Communications，Trends in Biotechnology， JACS Au，AM等期刊邀请为审稿人。

第一作者，杨小琴，兰州大学博士研究生，药物化学生物学方向。

第一作者，明巍，兰州大学博士研究生，药物化学生物学方向。

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