看DNA甲基化如何补充临床复杂病例的证据链？

疾病分型旨在更精准地认识疾病本质，为临床的精准诊断、个体化治疗和预后评估提供科学依据。但临床中，部分复杂病例仍难以利用病理形态、免疫组化和基因检测等常用分型方法获得一致解释，尤其是罕见病例，或样本量有限、组织成分复杂、基因组结果与临床表型之间缺少清晰对应的病例。

DNA甲基化为疾病分型提供了另一层证据。该方法不依赖单一CpG位点，而是比较待测样本的全基因组甲基化模式与经验证的参考类别，进而判断样本的分子亚型。目前，中枢神经系统（CNS）肿瘤分类和罕见病Episignature识别仍主要依托DNA甲基化array、固定CpG坐标和长期积累的参考数据库。而因美纳5-Base DNA Prep所带来的增量价值则在于：获得复杂病例或珍贵样本甲基化分类结果的同时，还可以获得同一份DNA的遗传变异和5mC信息。

在此，本文所讨论的并非技术的先进性，而是成熟分子分类体系需要怎样的稳定参考坐标，复杂病例又需要怎样的联合证据链。

01

甲基化分类的本质：建立稳定参考坐标

与围绕特定突变、扩增事件或蛋白指标展开的传统生物标志物检测不同，甲基化分类更接近全局模式识别，即利用多个CpG位点的组合特征判断样本与参考类别之间的整体相似度。

一个稳定的甲基化分类体系需要具备严格标注的参考病例、统一的数据预处理流程、明确的分类阈值，以及对低置信度、异常样本和无法分类结果的处理规则。CNS肿瘤分类器和EpiSign均建立在这一方法学框架之上[1] 。固定CpG坐标可将不同时间、不同机构的样本置于相同或可协调的特征空间，方便参考数据库的持续扩展和模型更新。

因此，甲基化分类体系的核心是检测平台、参考样本、算法模型和临床标签之间的长期一致性，而非探针数量。

02

成熟分类体系仍主要基于array建立

目前具备较成熟临床证据和标准工作流的DNA甲基化分类体系，仍主要基于甲基化array的数据生成和模型运行平台建立。甲基化array的优势在于可在固定CpG位点形成相对统一的数据结构，使参考样本、待测样本和后续新增病例使用相同或可协调的探针集合，并持续计算样本与疾病之间的分类分值。

此外，甲基化array已形成较成熟的质量控制与解释经验，包括信号强度、探针失败、批次效应、组织纯度和异常样本等都有相对明确的处理方法，并允许输出低置信度或无法分类结果，而不是强制将所有样本归为某一疾病类别[2]。

03

CNS肿瘤：甲基化分类进入整合诊断

CNS肿瘤是DNA甲基化临床分类的成熟应用场景之一。2018年，Capper等建立了覆盖不同年龄和实体瘤的CNS肿瘤DNA甲基化分类体系，并通过前瞻性和外部诊断队列验证了其与传统病理诊断的一致性与差异。研究发现，部分传统病理学难以稳定区分的肿瘤，可通过甲基化模式进行新的分类[1]。但甲基化分类并不是替代病理。当分类结果与原诊断不一致时，需要结合组织形态、取样位置、肿瘤纯度、拷贝数变化和其他分子证据重新评估。

2023年，一项纳入1,200余名新诊断儿童CNS肿瘤患者的前瞻性研究显示，DNA甲基化分析在约50%的病例中提供了更精细的分子分类信息，靶向基因检测在47%的病例中发现具有诊断或治疗意义的遗传改变，约10%的患者被识别出肿瘤易感综合征；病理与甲基化分类之间具有临床相关差异的病例约占5%。[4]

以上结果表明，病理、甲基化分类和基因组检测可解决不同问题：病理提供组织形态与临床背景，甲基化提供全局分子分型，基因组检测识别驱动事件、治疗相关变异和遗传易感性。当三方面结果相互支持时，诊断信心增加；当结果发生冲突时，冲突本身成为重新检查样本和诊断假设的起点。

04

从CNS到泛癌：分类器扩展依赖数据

DNA甲基化分类正由少数病种向更广泛的肿瘤类别拓展，但其基础仍是足够规模、经整理的参考数据。Tomasz团队整合了16,788份来自450K、EPIC v1和EPIC v2的甲基化图谱训练泛癌分类器和CNS分类器，其中泛癌部分覆盖54个正常组织和肿瘤类型，CNS部分覆盖59种肿瘤类型。结果显示，基于1,208个CpG建立的泛癌分类器，对54类正常和肿瘤类型的平衡准确率达到0.90；CNS分类器在59个肿瘤亚型中的平衡准确率达到0.94[3]。

以上研究表明，经协调的跨时间、机构和array版本的历史数据，可以将零散研究转化为新的分类资产。但基于组织样本建立的模型不能直接外推至cfDNA，样本处理方式、肿瘤纯度和平台差异等因素也可能影响模型表现，因此泛癌分类器目前仍需进一步临床验证。

05

Episignature：为未解表型增加功能性证据

在罕见病和未解表型中，WES或WGS可能已经发现候选变异，但与患者表型之间的关系仍不明确，尤其涉及VUS、非编码变异、剪接变异、CNV以及表型重叠的发育性疾病。

对此，Episignature可以提供另一层分类证据。部分染色质重塑、转录调控和发育相关疾病，可在外周血DNA中形成可重复的全基因组甲基化模式，即Episignature。EpiSign体系可通过比较患者甲基化图谱与疾病参考样本及正常对照，判断是否匹配特定疾病类别。

加拿大西安大略大学Bekim Sadikovic教授在《因美纳·表观新见》专家分享中强调，Episignature通常来自具有共同遗传病因、临床表型或暴露背景的患者队列，并可在外周血DNA中稳定检出；该体系的解释依赖持续扩展的EpiSign Knowledge Database，而不是孤立的CpG位点。

2024年的一项临床网络研究纳入2,399例病例，其中1,667例接受Episignature、印记区域和启动子区域的综合筛查，18.7%获得阳性报告；另有732例因VUS、CNV或临床疑诊接受靶向Episignature分析，32.4%获得阳性结果[5] ，证明了Episignature在罕见病中的诊断潜力。

总之，Episignature提供的是功能性分类证据：患者是否表现出与某疾病一致的全基因组调控模式。阳性结果可以支持候选变异或临床诊断，但阴性结果不能单独排除疾病或否定VUS，因为部分疾病存在变异类型、蛋白结构域、嵌合比例或亚型相关的甲基化差异。该研究也明确建议将结果分为高置信度阳性、中等置信度阳性、不确定和阴性等层级，并结合变异及临床信息解释。[5]

06

复杂病例需要多层分子证据

临床困难病例难以确诊多是因为已有结果无法形成完整解释。例如，病例可能获得甲基化分类，但遗传原因尚未明确；或发现了候选变异，却无法判断其是否产生与疾病一致的调控后果；部分病例还可能同时存在序列异常、CNV、印记异常或多个疾病过程。

Sadikovic教授分享了几个代表性研究病例。在一组既往WGS未解病例中，研究团队首先通过EPIC array和EpiSign发现疾病相关Episignature，再重新聚焦相关基因区域。例如，一例CHARGE综合征病例在EpiSign提示CHARGE相关表观特征后，深入分析发现CHD7中的278 bp Alu插入；一例Kabuki综合征病例则同时获得KMT2D深部内含子剪接变异和Kabuki相关Episignature；另有病例同时具有ATRX相关表观特征和Beckwith-Wiedemann相关印记异常，并在5-Base数据中观察到ATRX致病变异。

以上病例研究提示，复杂表型或包含多层分子异常，单一阳性结果未必能够解释患者的全部表现。甲基化分类可以帮助重新聚焦基因组分析，基因组结果也能反向解释甲基化分类信号。需要注意的是，上述病例来自特定研究队列，研究结论不能直接外推为所有未解表型病例的通用诊断路径。

07

5-Base的增量价值，不是替代成熟array分类器

现阶段，CNS肿瘤分类和Episignature等成熟体系仍主要建立在array数据之上。5-Base并非替代成熟array分类器，而是更适用于同时需要基因组和5mC信息的复杂病例或研究场景。

5-Base可利用同一份DNA、一次文库制备和同一批测序数据，同时获得CpG 5mC以及SNV、Indel和CNV等基因组信息。这种能力使其可在三类场景中提供增量价值：

第一，同一样本联合检测。对于有限样本、家系病例或部分珍贵样本，甲基化和遗传变异联合检测可以减少样本拆分和批次协调。

第二，辅助解决未明确的遗传原因。当甲基化分类已提示疾病方向，而遗传原因未明确时，Episignature可以帮助缩小基因组分析范围，基因组数据则用于寻找复杂插入、深部内含子变异、CNV等候选事件。

第三，新分类特征探索。对尚没有成熟分类器的疾病，5-Base可以探索array未覆盖的全基因组5mC区域，并保留遗传背景。但新发现仍需在足够规模的参考队列中进行特征筛选、模型训练和独立验证。

此外，Sadikovic团队在45例已知罕见病样本中开展了研究性桥接验证，涉及22类Episignature条件、复杂致病变异、CNV和印记缺陷。报告显示，该特定样本集中，已知遗传变异与疾病相关甲基化模式均可被观察。由于该结果来自专家报告中的研究性验证，其适用范围应限定在样本构成和既有EpiSign模型之内。

因此，5-Base更准确的定位不是“替代array做分类”，而是在部分复杂病例中，使甲基化分类信号与基因组变异尽可能来自同一份DNA。

08

不同场景下，array与5-Base应如何分工

上述分工的核心并不是划定固定的技术边界，而是区分成熟模型调用和新证据发现：前者更依赖固定参考坐标、数据库和长期验证；后者更关注同一样本的信息完整度与全基因组探索能力。

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结语｜分类依赖稳定坐标，复杂病例需要更完整的证据链

在CNS肿瘤和Episignature等成熟应用场景中，array仍然是核心数据基础和模型支撑。不同于单基因检测的分类思路，DNA甲基化分型是通过比较样本与现有疾病、组织或分子亚型的全基因组甲基化参考图谱判定分型。5-Base的价值并非替代现有array体系，而在于针对复杂病例的补充检测能力，实现统一病例背景下同源DNA的遗传变异与5mC联合解读。

因此，array与5-Base各司其职：

array支撑成熟甲基化分类与模型调用；
5-Base适配复杂病例的“分类信息＋基因组联合解读”研究场景。

对于妇科肿瘤等甲基化分型体系尚未成熟的领域，无需照搬其他病种的分类器，而是立足临床疑难病例，逐步搭建经病理复核、分子分析和独立验证的本土参考体系。

未来，5-Base能否普及常规分类应用，关键不在于CpG的覆盖数量，而取决于能否与既有array知识库完成系统桥接，并在多中心、多病例的真实场景中验证应用稳定性。

参考文献（滑动查看）：

1.Capper D, Jones DTW, Sill M, et al. DNA methylation-based classification of central nervous system tumours. Nature. 2018;555:469–474. doi:10.1038/nature26000.

2.Sturm D, Capper D, Andreiuolo F, et al. Multiomic neuropathology improves diagnostic accuracy in pediatric neuro-oncology. Nature Medicine. 2023;29:917–926. doi:10.1038/s41591-023-02255-1.

3.Bińkowski J, Wojdacz TK. DNA methylation biomarkers-based pan-cancer classifier: predictive modeling for cancer classification. Genome Medicine. 2026;18:66. doi:10.1186/s13073-026-01650-w.

4.Sadikovic B, Levy MA, Kerkhof J, et al. Clinical epigenomics: genome-wide DNA methylation analysis for the diagnosis of Mendelian disorders. Genetics in Medicine. 2021;23:1065–1074. doi:10.1038/s41436-020-01096-4.

5.Kerkhof J, Rastin C, Levy MA, et al. Diagnostic utility and reporting recommendations for clinical DNA methylation episignature testing in genetically undiagnosed rare diseases. Genetics in Medicine. 2024;26:101075. doi:10.1016/j.gim.2024.101075.

6.Illumina. Illumina 5-Base DNA Prep. Product information and technical documentation. 2026.

7.Illumina. DRAGEN 5-Base DNA Pipeline Product Guide, v4.5.

仅供科研使用，不用于诊断程序。

因美纳《表观新见》系列报道之“甲基化array联合5-Base的罕见病应用”

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