没有高精尖鉴定设备，基层也能做好棒状杆菌检验

正文共： 2333字

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作者：王苗

单位：金昌市人民医院检验科

1、引言

MALDI-TOF质谱是大型医院细菌精准鉴定重要手段，棒状杆菌专用生化、药敏试剂盒可实现标准化检测。但乡镇卫生院、社区卫生中心等基层机构普遍无质谱设备，专用检测试剂采购难、成本高，无法规范开展棒状杆菌全套检验，难以指导临床抗感染用药。

棒状杆菌多为需氧/兼性厌氧苛养菌，溶血隐秘杆菌等条件致病菌可引发皮肤、呼吸道、血流感染。CLSI M45文件明确了棒状杆菌药敏试验标准，但标准体系依赖专用耗材，基层难以落地。本文利用实验室常规试剂搭建低成本、可复制的改良检测体系，为基层微生物检验提供实操参考。

2、材料与方法

2.1 试验材料

临床疑似棒状杆菌分离菌株；5%羊血琼脂、麦康凯琼脂、半固体动力培养基；触酶、氧化酶生化试剂；葡萄球菌生化鉴定板、葡萄球菌微量肉汤药敏板、奈瑟菌药敏肉汤、新鲜人血；质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠埃希菌ATCC25922、流感嗜血杆菌ATCC49247；全自动微生物鉴定药敏系统、35～37℃恒温孵箱、光学显微镜。

2.2 棒状杆菌属水平初筛

（1）形态学鉴定：革兰阳性杆菌，菌体两端膨大呈棒状，排列呈栅栏状、V形、Y形；无芽孢、无鞭毛、无动力。镜检若见具动力、产芽孢或抗酸染色阳性的菌株应直接排除。35℃孵育24 h，羊血平板可见灰白色细小菌落，部分伴轻度β溶血，菌株无法在麦康凯琼脂生长。

（2）生化初筛标准：35℃孵育24 h，同时满足触酶阳性、氧化酶阴性、无动力、葡萄糖发酵阳性，即可初步判定为棒状杆菌属。

2.3 菌种鉴别改良方法

使用葡萄球菌生化鉴定板完成硝酸盐还原、尿素水解、多种糖类发酵等鉴别关键项目；生化结果录入全自动鉴定系统，调取内置棒状杆菌专属数据库完成菌种判定。

2.4 改良微量肉汤稀释药敏检测

（1）改良肉汤配制：普通葡萄球菌肉汤营养匮乏，无法满足苛养菌生长需求；以奈瑟菌药敏肉汤为基底，添加5%裂解羊血以达到CLSI对苛养菌生长的血液营养要求；检测达托霉素时补充钙离子至50 μg/mL。

（2）试验操作：纯菌落制备0.5麦氏浊度菌悬液，改良肉汤稀释后加入药敏板，35℃空气环境孵育24～48 h；读取各药物MIC值，参照CLSI M45棒状杆菌专属折点划分敏感（S）、中介（I）、耐药（R）；每批次同步开展室内质控。

（3）方法规范：CLSI推荐棒状杆菌首选药物为青霉素、万古霉素、庆大霉素、红霉素；仅认可微量肉汤稀释法、E试验、琼脂稀释法，不推荐纸片扩散法。

3 结果

3.1 属水平初筛结果

典型棒状杆菌形态联合四项生化阳性可快速归类菌株；存在动力、芽孢、抗酸阳性的干扰菌株可直接剔除，初筛无需专用试剂，判定效率高。

3.2 菌种鉴定结果

葡萄球菌生化板覆盖棒状杆菌种间鉴别全部核心生化反应，临床分离溶血隐秘杆菌鉴定概率98.27%，相似度1.00，分型结果稳定可靠。

3.3 改良药敏体系检测结果

直接使用葡萄球菌肉汤时菌株生长微弱，MIC无法判读；奈瑟菌肉汤联合新鲜人血改良基质可显著促进菌株增殖，孵育48 h可清晰区分生长孔（黄色）与未生长孔（红色）。溶血隐秘杆菌药敏结果显示四环素、复方新诺明耐药，其余药物MIC值均可依据CLSI M45标准规范判读，试验重复性良好。

4、讨论

4.1 基层检测主要难点

一是质谱设备购置、维护成本高，基层无力配置；二是棒状杆菌专用试剂盒采购渠道有限、单价高，试剂储备压力大；三是棒状杆菌为苛养菌，普通肉汤营养不足易造成假敏感；四是基层检验人员不熟悉CLSI M45苛养菌标准，常误用葡萄球菌折点，导致药敏报告失真。

4.2 本方案应用优势

（1）耗材通用，成本低廉：整套方案仅使用实验室常备葡萄球菌板、奈瑟菌肉汤等试剂，无需单独采购棒状杆菌专用试剂盒；

（2）分层鉴定，精准高效：简易生化初筛缩小目标菌株范围，自动化系统完成精准分型，常见致病菌鉴定匹配度超98%；

（3）改良肉汤适配苛养特性：添加人血满足CLSI苛养菌血液营养要求，消除菌株生长不良带来的MIC检测误差；

（4）药敏判读标准化：统一采用棒状杆菌专属折点，从源头规避药敏结果误判；

（5）操作门槛低，易推广：全部为微生物常规基础操作，无需专项培训，适配乡镇、社区医疗机构。

4.3 方案局限与操作注意事项

葡萄球菌生化板对极罕见棒状杆菌鉴别能力不足，罕见菌株建议送上级医院质谱复核；新鲜人血配制改良肉汤需严格落实生物安全防护，无新鲜人血可替换商品化5%裂解羊血；孵育时长严格控制24～48 h，不可参照葡萄球菌短孵育标准；达托霉素药敏检测必须补充钙离子，否则易出现假敏感。

5、结论

本研究构建的分层初筛+通用生化板菌种鉴定+改良微量肉汤稀释法药敏一体化方案，仅依靠基层常规设备与耗材，检测流程符合CLSI M45规范，可完整实现棒状杆菌属鉴定与MIC药敏检测，有效填补基层因设备、试剂短缺形成的检测空白。该方案成本低、实操性强，适合各级基层医疗机构推广，可为临床棒状杆菌感染抗菌药物合理选用提供稳定可靠的实验室依据。

【参考文献】

[1] 陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M].北京:人民卫生出版社,2011.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria[S]. CLSI document M45. 3rd ed. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2016.

来源：”检验医学网“微信公众号

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