JHEP Rep (1区)｜瞄准MASH新靶点：新型MAP4K4抑制剂GPPD通过MAP4K4-CaMK2轴减轻脂肪变、炎症与纤维化！(得克萨斯农工大学)

2026年8月8日，美国得克萨斯农工大学Aditya D. Joshi团队与俄克拉荷马大学健康科学中心Vibhudutta Awasthi团队等，在JHEP Reports（中科院医学1区，最新Impact Factor=8.7）在线发表题为“A novel pharmacological inhibitor of MAP4K4 activity attenuates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis”的研究论文。Felix Ampadu为第一作者，Vibhudutta Awasthi和Aditya D. Joshi为共同通讯作者。该文于2025年11月11日投稿，2026年4月21日修回，4月26日接收，5月4日在线发表。

该研究聚焦丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）这一潜在MASH治疗靶点，并评价新型小分子抑制剂葡糖基吡咯并嘧啶酮（glucosyl pyrrolo-pyrimidinone，GPPD）的作用。研究通过MASLD患者肝组织、多个体外肝细胞模型、30周饮食诱导MASH小鼠模型及单核RNA测序等多层次证据发现，MAP4K4在MASLD/MASH中显著上调；药理性抑制MAP4K4不仅能够减少肝细胞脂质蓄积，还可减轻动物模型中的肥胖、肝脂肪变、炎症、肝损伤及纤维化。机制研究进一步将钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMK2）锁定为MAP4K4下游关键节点，提出MAP4K4-CaMK2轴可能是GPPD发挥肝保护作用的重要机制。

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【摘 要】

背景与目的：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）是一种进行性疾病，也是全球肝脏相关疾病负担的重要原因。其进展期形式——代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH），主要表现为肝脂肪变、炎症、肝细胞气球样变和纤维化。本研究旨在探讨丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4，MAP4K4）作为治疗靶点的重要性，并评价一种新型小分子抑制剂葡糖基吡咯并嘧啶酮（glucosyl pyrrolo-pyrimidinone，GPPD）减轻MASH的作用。

方法：研究采用免疫组织化学方法检测健康人群（n=5）及MASLD患者（n=20）肝活检组织中的MAP4K4表达。在体外实验中，利用油酸（oleic acid，OA）处理人原代肝细胞、小鼠肝类器官、HepG2和AML12细胞，并评价GPPD处理及遗传性沉默MAP4K4的作用。体内实验中，小鼠接受高脂、高果糖、高胆固醇饮食并给予GPPD干预30周，每组n=8。进一步采用单核RNA测序（single-nuclei RNA sequencing，snRNA-seq）分析肝脏，以解析GPPD发挥肝保护作用的分子机制。数据采用ANOVA模型进行分析，以均值±标准差表示，p<0.05认为差异具有统计学意义。

结果：与健康对照相比，MASLD患者肝脏MAP4K4表达显著升高，并与疾病严重程度相关。在多个体外模型中，无论遗传性沉默MAP4K4还是GPPD处理，均可显著减轻脂肪变。体内实验显示，预防性给予GPPD可降低体重增长和脂肪蓄积，同时减轻肝脂肪变、炎症、肝损伤及纤维化。机制上，尽管GPPD能够直接抑制MAP4K4活性，其肝保护作用同时与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMK2）信号受到抑制密切相关。

结论：GPPD可通过调控MAP4K4-CaMK2轴减轻伴纤维化的脂肪性肝炎。进一步研究GPPD有望推动其作为MASH潜在治疗策略的后续开发。

01

研究背景及科学问题

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是最常见的慢性肝病之一，在美国约影响四分之一的人群，并常与肥胖和糖尿病同时存在。其疾病谱从单纯脂肪变一直延伸至严重的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），后者还可进一步发展为肝硬化，最终甚至进展为肝细胞癌。

MASH是一种以肝脂肪变、肝细胞气球样变、炎症和纤维化为特征的复杂疾病。由于其病因涉及多种因素，目前MASLD发生发展的确切机制仍未完全阐明。已有药物主要针对部分具有中重度纤维化的患者，因此，仍有必要发现新的治疗靶点，并开发能够同时干预MASH形态学改变和代谢异常的小分子药物。

MAP4K4属于Ste20样激酶家族，参与肿瘤、心血管疾病、炎症和代谢性疾病等多种病理生理过程。已有研究观察到肝脏MAP4K4表达与临床MASLD活动度评分呈正相关。在OA处理的肝细胞中，MAP4K4过表达可加重脂肪变，而沉默MAP4K4则可减轻脂肪变及脂毒性。

尽管MAP4K4在临床前研究中受到关注，但目前仍属于尚未得到充分验证的治疗靶点。早期MAP4K4抑制剂未能表现出理想的安全性，因此仍需要开发新一代小分子抑制剂。

本研究进一步证实，MAP4K4在MASLD患者肝脏、饮食诱导MASH动物模型以及MASLD体外模型中均出现上调。在此基础上，研究首先对MAP4K4这一靶点进行验证，随后评价新合成的MAP4K4抑制剂GPPD的预防性干预潜力。结果表明，GPPD能够保护肝细胞免受脂毒性损伤，并减轻脂肪蓄积及MASH相关病理改变，其肝保护效应与MAP4K4调控的CaMK2信号受到抑制有关。

02

重要发现及亮点

MASLD患者及多种疾病模型中肝脏MAP4K4表达升高

研究首先检测5例健康对照和20例无饮酒史、存在肝脂肪变的MASLD患者肝活检组织。免疫荧光结果显示，与健康肝组织相比，MASLD患者肝组织中的MAP4K4表达明显升高。

随后，研究在OA诱导的HepG2细胞、AML12细胞以及小鼠原代肝细胞模型中进一步进行验证。结果显示，在所有OA处理的细胞模型中，MAP4K4表达均显著升高（p<0.01），提示MAP4K4上调并非局限于患者肝组织，而是在多种MASLD实验模型中具有一致性。

图1：MASLD中肝脏MAP4K4表达上调。（A）采用抗MAP4K4抗体检测包含20例MASLD患者肝活检组织（男性13例、女性7例）和5例健康个体（男性3例、女性2例）的肝组织芯片。展示健康肝组织和MASLD肝组织中MAP4K4表达的代表性图像，并对平均荧光强度进行定量。（B）HepG2细胞、AML12细胞及小鼠原代肝细胞采用500 μM OA处理24 h，并使用抗MAP4K4抗体检测MAP4K4表达。比例尺=170 μm；绿色为MAP4K4，蓝色为DAPI。数据以均值±SD表示。MASLD患者与健康个体之间以及OA组与Vehicle组之间的比较采用Welch’s t检验。与健康个体或Vehicle组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。MASLD：代谢功能障碍相关脂肪性肝病；OA：油酸。

沉默MAP4K4可减轻OA诱导的脂肪变和脂质生成

为验证MAP4K4在MASLD中的功能意义，研究分别在AML12细胞和小鼠原代肝细胞中通过RNA干扰降低MAP4K4表达，并观察OA刺激后的脂质蓄积。

在AML12细胞中，MAP4K4敲低后，OA诱导的Oil Red O脂质染色明显减弱。与此同时，长链脂肪酸摄取也明显下降。与对照细胞相比，OA处理且MAP4K4沉默的细胞中，游离脂肪酸（FFA）和三酰甘油含量分别降低约40%和65%。

基因表达分析显示，MAP4K4沉默显著降低负责长链脂肪酸摄取的CD36，同时抑制Scd1、Srebp1和Gpat1等从头脂质生成相关基因，并明显上调参与线粒体β-脂肪酸氧化的Cpt1。此外，促炎相关MCP1和F4/80表达也受到抑制。OA刺激的小鼠原代肝细胞中亦获得了相似结果，进一步支持MAP4K4参与肝细胞脂质代谢及脂毒性过程。

GPPD直接抑制MAP4K4活性并减轻体外脂肪变

在遗传学验证基础上，研究进一步评价新合成的MAP4K4小分子抑制剂GPPD。重组MAP4K4激酶活性实验显示，GPPD抑制MAP4K4激酶活性的IC50约为15 nM。

在OA处理的HepG2细胞中，GPPD并未明显降低OA诱导的MAP4K4蛋白表达，但能够显著抑制MAP4K4激酶活性，提示该化合物主要通过直接抑制激酶活性发挥作用。

进一步在HepG2细胞、人原代肝细胞、AML12细胞和小鼠肝类器官中进行验证。BODIPY 493/503染色显示，GPPD显著降低OA诱导的脂质蓄积（p<0.0001）。在HepG2细胞中，OA诱导的FFA摄取、细胞内FFA及三酰甘油含量也均明显下降。

与此同时，GPPD显著抑制CD36、GPAT1、DGAT1、SREBP1和SCD1等参与脂肪酸摄取和脂质合成的基因，并降低MCP1和F4/80等炎症相关基因表达。上述结果表明，GPPD能够干预肝细胞脂质摄取和代谢过程，从而减轻体外MASLD模型中的脂肪变。

图2：GPPD减轻体外MASLD模型中的脂肪变相关表型。（A）GPPD的化学结构。（B）不同浓度GPPD处理条件下重组MAP4K4的激酶活性。（C）HepG2细胞分别给予Vehicle、OA（500 μM）、GPPD（100 μM）及OA+GPPD处理24 h后检测MAP4K4表达。展示代表性Western blot图像，并对以Actin为上样内参归一化的MAP4K4表达进行定量。（D）使用抗MAP4K4抗体免疫沉淀MAP4K4，并使其磷酸化髓鞘碱性蛋白（MBP）底物，以检测MAP4K4活性。反应体系中磷酸化MBP水平采用抗磷酸化MBP抗体通过Western blot检测，柱状图显示磷酸化MBP与免疫沉淀MAP4K4条带强度的相对比值。（E）HepG2细胞、人原代肝细胞、AML12细胞及小鼠肝类器官BODIPY 493/503（绿色）和DAPI（蓝色）染色代表性图像，比例尺=170 μm，并对BODIPY 493/503平均荧光强度进行定量。（F）HepG2细胞给予Vehicle或GPPD（100 μM）处理24 h后，再使用BODIPY-十二烷酸处理1 h检测FFA摄取。（G）HepG2细胞中的FFA含量。（H）三酰甘油含量。（I）采用实时定量PCR检测参与FFA摄取、从头脂质生成和炎症的相关基因mRNA水平，并以18S rRNA进行归一化。激酶活性数据采用四参数Logistic剂量-反应抑制模型进行非线性回归拟合，以计算IC50；未加入GPPD的对照反应作为参考。根据数据类型采用单因素ANOVA结合Dunnett多重比较检验或Student’s t检验。数据以均值±SD表示，n=6；与Vehicle组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。FFA：游离脂肪酸；GPPD：葡糖基吡咯并嘧啶酮；MASLD：代谢功能障碍相关脂肪性肝病；MBP：髓鞘碱性蛋白；OA：油酸。

GPPD降低饮食诱导MASH小鼠的体重增长和脂肪蓄积

在体外实验获得保护作用后，研究进一步在C57BL/6J小鼠中评价GPPD的预防性作用。小鼠连续30周给予对照饮食（CD）、高脂/高果糖/高胆固醇MASH饮食（MD），或MD联合GPPD。

与CD组相比，MD组小鼠体重显著增加，而GPPD干预明显降低体重增长和肝脏质量。体成分分析进一步显示，GPPD处理降低脂肪质量，并显著提高瘦体质量比例（p<0.001）。同时，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）重量及其与体重的比值下降，脂肪细胞面积也明显减小。

GPPD还提高iWAT中细胞色素c氧化酶亚基IV（COX IV）的表达，提示线粒体活性及可能的产热过程增强。值得注意的是，MD与MD+GPPD组之间的食物摄入量并无显著差异，说明体重和脂肪量下降并非由摄食减少所致。

代谢笼检测显示，GPPD显著提高能量消耗，同时增加氧耗量（VO2）和二氧化碳产生量（VCO2）。而MD和MD+GPPD组小鼠的运动距离并无显著差异，提示GPPD所引起的能量消耗增加并不能简单归因于活动量增加。

图3：GPPD在饮食诱导的MASH体内模型中抑制体重增长并减轻脂肪蓄积。C57BL/6J小鼠分别给予对照饮食（CD）、高脂/高果糖/高胆固醇MASH饮食（MD），以及MD联合GPPD处理。GPPD剂量为10 mg/kg体重，每周一、周三和周五腹腔注射，持续30周。（A）体重。（B）以初始体重百分比表示的标准化体重。（C）30周研究结束时的体重。（D）30周时肝脏重量。（E）第30周肝重占体重百分比。（F）采用EchoMRI检测瘦体质量和脂肪质量的百分比组成。（G）研究结束时腹股沟白色脂肪组织（iWAT）重量。（H）第30周iWAT占体重百分比。（I）iWAT的H&E染色代表性图像，比例尺=170 μm；旁图采用ImageJ及ATAT v1.1.27插件测定平均白色脂肪细胞面积，每只小鼠分析40–400个细胞。（J）COX IV表达的代表性Western blot图像及以Actin归一化后的定量。（K）根据每周平均摄食量计算的平均每日食物摄入量。（L）24 h内标准化能量消耗。（M）24 h总能量消耗。（N）24 h氧耗量（VO2）。（O）24 h每日总氧耗量。（P）24 h二氧化碳产生量（VCO2）。（Q）每日总二氧化碳产生量。（R）小鼠在笼中的运动距离。数据以均值±SD表示，除F及K–R外均n=8；F及K–R中CD组n=4，MD组和MD+GPPD组n=6。时间序列数据A、B、L、N和P采用双因素ANOVA并进行Dunnett多重比较检验；终点指标C–K、M、O、Q和R采用单因素ANOVA并进行Dunnett多重比较检验。n.s.=差异无统计学意义；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。COX IV：细胞色素c氧化酶亚基IV；GPPD：葡糖基吡咯并嘧啶酮；MASH：代谢功能障碍相关脂肪性肝炎。

GPPD减轻MASH小鼠肝脂肪变、炎症、纤维化及肝损伤

研究分别采用H&E、天狼猩红（Picrosirius Red）和F4/80染色评价肝脂肪变、纤维化和炎症。结果显示，MD可诱导明显的脂肪变、肝细胞气球样变、纤维化和炎症，表现为脂滴增加、胶原沉积和炎症细胞浸润，而GPPD可显著减轻上述MASH组织病理学改变（p<0.05）。

此外，与MD组相比，GPPD显著降低肝组织三酰甘油和胆固醇含量，并降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，提示肝损伤得到减轻。

RT-qPCR结果进一步显示，GPPD抑制参与脂肪酸转运的CD36，以及参与从头脂质生成和三酰甘油合成的Acc1、Scd1、Srebp1、Gpat1、Gpat2和Dgat1，同时降低TNFα和TGFβ等炎症相关基因。纤维化相关Col1a1和Acta2也显著受到抑制。

值得注意的是，MD组肝组织MAP4K4蛋白表达和激酶活性均明显升高，而GPPD虽然并未显著降低MAP4K4蛋白表达，却几乎完全抑制其升高的激酶活性，与体外实验结果一致。综合来看，GPPD通过抑制MAP4K4激酶活性，减轻了伴纤维化脂肪性肝炎的多项核心病理表型。

图4：GPPD保护小鼠免受饮食诱导的脂肪性肝炎。小鼠饮食和处理方案同图3。（A）肝组织H&E、Picrosirius Red及F4/80染色代表性图像，比例尺=170 μm；柱状图显示NAS评分和Brunt纤维化评分。（B）肝脏三酰甘油含量。（C）肝脏胆固醇含量。（D）血清ALT水平。（E）采用RT-qPCR检测参与FFA摄取、从头脂质生成、炎症及纤维化的相关基因表达，并以18S rRNA归一化。（F）MAP4K4代表性Western blot及以Actin归一化后的定量。（G）肝组织MAP4K4活性。采用抗MAP4K4抗体从肝组织裂解液中免疫沉淀MAP4K4，并使其磷酸化MBP底物；反应体系中的磷酸化MBP采用抗磷酸化MBP抗体通过Western blot检测，柱状图显示磷酸化MBP与免疫沉淀MAP4K4的相对条带强度比值。数据以均值±SD表示，n=8。NAS和Brunt纤维化评分采用Kruskal–Wallis检验并进行Dunn多重比较；B–G采用单因素ANOVA并进行Dunnett多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。ALT：丙氨酸氨基转移酶；CD：对照饮食；FFA：游离脂肪酸；GPPD：葡糖基吡咯并嘧啶酮；MBP：髓鞘碱性蛋白；MD：MASH高脂/高果糖/高胆固醇饮食；NAS：非酒精性脂肪性肝病活动度评分。

GPPD通过调控CaMK2信号减轻脂肪性肝炎

为解析GPPD的作用机制，研究对CD、MD及MD+GPPD小鼠肝组织进行了单核RNA测序。结果识别出多种肝实质及非实质细胞群，并显示MD和MD+GPPD组的肝脏微环境发生明显重塑。

在肝细胞中，研究重点分析GPPD处理后的激酶表达变化，发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMK2）以及非典型激酶MAPK15出现明显变化。其中，在中央区、中中央区和门管区肝细胞中，CaMK2β亚型（Camk2b）以及整体CaMK2模块评分在MD+GPPD组均低于MD组。

在肝星状细胞中，GPPD也降低了Camk2a和Camk2b表达，但这两种亚型的相对丰度较低；在内皮细胞及Kupffer细胞中，GPPD并未明显改变Camk2b。Western blot进一步证实，GPPD处理降低了肝组织CaMK2总蛋白及其磷酸化水平。

图5：GPPD调控CaMK2信号。（A）整合肝组织单核转录组的UMAP图，展示主要肝实质和非实质细胞类型。（B）CD、MD和MD+GPPD不同饮食条件下各细胞类型比例的堆叠柱状图。（C–E）MD+GPPD组相较MD组在中央区肝细胞（C）、中中央区肝细胞（D）和门管区肝细胞（E）中的差异表达基因火山图，其中Camk2b以蓝点标示；横坐标和纵坐标分别表示log2 fold change和−log10(FDR)。（F）肝细胞中全部CaMK2亚型综合评分热图，以及各CaMK2亚型表达的点图。（G）CD、MD及MD+GPPD小鼠肝组织CaMK2和磷酸化CaMK2的代表性Western blot。（H）CaMK2表达定量，以Actin归一化并相对于CD组表示。（I）磷酸化CaMK2/CaMK2比值，相对于CD组表示。单核RNA-seq分析（C–F）的差异表达采用DESeq2并进行FDR多重检验校正。Western blot定量（H、I）数据以均值±SD表示，n=8，采用单因素ANOVA并进行Dunnett多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。CD：对照饮食；GPPD：葡糖基吡咯并嘧啶酮；MD：MASH高脂/高果糖/高胆固醇饮食。

CaMK2过表达可消除GPPD的肝细胞保护作用

为了进一步判断CaMK2是否位于MAP4K4下游，研究在小鼠原代肝细胞中过表达Camk2b。

结果显示，CaMK2过表达细胞对GPPD的反应明显减弱。在OA刺激并给予GPPD后，过表达细胞中的Camk2b仍维持较高水平。虽然GPPD在对照细胞及Camk2b过表达细胞中均可降低Map4k4 mRNA，但BODIPY脂质染色显示，当CaMK2被过表达后，GPPD已经无法有效降低OA诱导的脂质蓄积。这一结果支持CaMK2是GPPD发挥抗脂肪变作用的重要下游效应节点。

由于CaMK2激活与细胞内Ca2+升高密切相关，研究进一步检测细胞质钙水平。GPPD显著降低OA诱导的小鼠原代肝细胞胞质Ca2+升高（p<0.001）。此外，在MD+GPPD小鼠肝脏中，Akt磷酸化增加，而JNK磷酸化下降。

综合这些结果，研究认为GPPD通过抑制MAP4K4活性，进一步抑制下游CaMK2信号，同时增强促存活Akt信号并降低促凋亡JNK信号，从而减轻肝细胞脂肪变及相关损伤。

图6：肝细胞中过表达CaMK2可消除GPPD的保护作用。小鼠原代肝细胞分别给予Vehicle（Control）、OA（500 μM）以及OA+GPPD（100 μM）处理24 h。进行CaMK2过表达时，细胞在OA或OA+GPPD处理前24 h转染Camk2b/pCMV-SPORT6质粒。（A）Western blot检测CaMK2，Actin作为上样内参。（B）Camk2b mRNA表达，并以18S rRNA归一化。（C）Map4k4 mRNA水平，并以18S rRNA归一化。（D）小鼠原代肝细胞BODIPY 493/503（绿色）和DAPI（蓝色）染色代表性图像，比例尺=170 μm。数据以均值±SD表示，n=3。统计学显著性采用单因素ANOVA并进行Dunnett多重比较检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。GPPD：葡糖基吡咯并嘧啶酮；OA：油酸。

【贡献】★★★★★

本研究表明，GPPD介导的MAP4K4抑制能够显著改善慢性MASH模型中的肝脂肪变、炎症和纤维化。MAP4K4-CaMK2信号轴的调节可能是这一作用的重要机制，并有助于恢复代谢稳态。

研究由此筛选并验证了一种具有潜力的小分子候选化合物GPPD，为后续开发针对代谢性肝病的药物提供了实验依据，同时也为通过非经典激酶信号通路干预MASH提供了新的研究思路。需要注意的是，本研究目前主要采用预防性动物给药模式，其在已经建立MASH后的治疗作用仍有待后续研究进一步验证。

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