Nucleic Acids Res | 致病性RBM20胞质颗粒扰乱心肌细胞RNA剪接网络

RNA 可变剪接是调控基因表达和蛋白质多样性的重要机制，其异常与多种心血管疾病密切相关【1,2】。 RNA 结合蛋白 RBM20 是心肌中重要的可变剪接因子，可调控包括编码 肌联蛋白 （ TTN , Titin ） 在内的多个心脏功能相关基因【3】。 正常情况下， RBM20 主要定位于细胞核，在 TTN 转录位点形成特征性的 核内斑点 （ nuclear speckles ），并调控 TTN 及其他心脏相关基因的可变剪接【3-5】。 部分与扩张型心肌病（ dilated cardiomyopathy ， DCM ）相关的 RBM20 致病突变位于其精氨酸 / 丝氨酸富集结构域（ RS domain ），可破坏 RBM20 的核定位，导致其在胞质中异常聚集并形成 RBM20 胞质颗粒（ cytoplasmic RBM20 granules ）【6】。

过去认为，这类 RBM20 突变主要通过造成 RBM20 核内功能缺失及其靶基因异常剪接而导致心肌病【3】。然而，越来越多证据提示，异常形成的 RBM20 胞质颗粒本身也可能具有独立的致病作用【7】。美国威斯康星大学麦迪逊分校 过伟 团队此前研究发现，在携带致病性 Rbm20 S639G 突变的小鼠中，通过反义寡核苷酸（ antisense oligonucleotide ， ASO ）降低 RBM20 表达，可以减少胞质颗粒并改善心脏功能，尽管经典 RBM20 靶基因的异常剪接并未得到恢复。这一现象提示， RBM20 胞质颗粒可能通过目前尚不明确的机制产生 毒性获得性功能 （ toxic gain-of-function ）【7】。然而， RBM20 正常核内斑点和致病性胞质颗粒究竟包含哪些蛋白？这些胞质颗粒是否会影响其他 RNA 结合蛋白的功能，并进一步扰乱 RBM20 经典靶基因之外的 RNA 剪接，仍有待阐明。

在此基础上，过伟团队进一步开展研究，并于近日在Nucleic Acids Research杂志发表题为 Cytoplasmic RBM20 granules modulate non-RBM20 target splicing through interactions with other splicing factors 的研究论文。该研究利用原位邻近标记蛋白质组学（in situproximity labeling proteomics），系统解析了RBM20核内斑点和致病性胞质颗粒的蛋白组成，并发现胞质RBM20颗粒与剪接因子CELF1和MBNL2相关联，同时伴随这些剪接因子下游靶基因的异常剪接。研究表明，致病性RBM20胞质颗粒可能通过影响其他剪接因子的功能，进一步扰乱RBM20经典靶基因之外的RNA剪接网络，为理解RBM20心肌病中不同于单纯核内功能缺失的致病机制提供了新的线索。

为了明确 RBM20 核内斑点和胞质颗粒的蛋白组成，研究人员利用 TurboID 原位邻近标记 结合蛋白质组学 ，分别分析野生型 RBM20 核内斑点和致病突变 RBM20 胞质颗粒。研究共鉴定出 25 个核内斑点相关蛋白和 12 个胞质颗粒相关蛋白。功能富集分析显示，核内斑点主要富集 RNA 剪接、 RNA 代谢和转录调控相关蛋白，而胞质颗粒中则富集了多种其他胞质 RNA 颗粒相关蛋白。进一步比较发现， CELF1 、 CELF2 、 FUBP1 、 MBNL2 、 PTBP3 、 QKI 、 RBMS1 和 ZC3HAV1 等 8 种蛋白同时存在于两类 RBM20 颗粒中，提示致病性 RBM20 突变可能改变部分 RNA 调控蛋白的亚细胞分布。

在这些候选蛋白中，研究人员重点关注了心脏可变剪接因子 CELF1 和 MBNL2 。免疫共沉淀和免疫荧光结果显示， CELF1 和 MBNL2 均与 RBM20 相关。在正常成年小鼠心肌细胞中，两者与 RBM20 共同定位于核内斑点；而在携带 Rbm20 S639G 致病突变的心肌细胞中，则与 RBM20 胞质颗粒共定位。同时， CELF1 和 MBNL2 在突变心脏胞质组分中的丰度均有所增加，提示 RBM20 胞质颗粒可能影响其他剪接因子的亚细胞分布及功能。

随后，研究人员分析 RNA- seq 数据，发现多个 CELF1 和 MBNL2 靶基因在 Rbm20 S639G 小鼠心脏中发生异常剪接，包括 CELF1 靶基因 Ablim1 和 Atp2b1 ，以及 MBNL2 靶基因 Prune2 和 Tmed2 ，并通过 RT-PCR 进行了验证。为了判断这些剪接异常是否由 RBM20 正常功能缺失所致，研究人员进一步比较了不同 RBM20 功能缺失 动物模型。与 Rbm20 S639G 小鼠不同，在丧失 RBM20 剪接活性的 Rbm20 ΔRRM （ RNA recognition motif ） 小鼠中，并未观察到上述 CELF1 和 MBNL2 靶基因的剪接异常；在 RBM20 完全缺失 （ knockout ） 的大鼠中，大多数剪接变化同样未出现。这表明，这些 基因 的异常剪接并非由 RBM20 核内功能缺失所致，而可能与胞质 RBM20 颗粒的形成有关。

最后，研究人员利用此前建立的 ASO 降低 RBM20 表达并减少胞质颗粒的模型，进一步验证这一联系。结果发现， RBM20 胞质颗粒减少后， MBNL2 靶基因的异常剪接 呈部分 恢复趋势，而 CELF1 靶基因则未见明显改善。这些结果进一步支持 RBM20 胞质颗粒可能通过影响其他剪接因子的功能，扰乱其下游 RNA 剪接。

综上所述，该研究系统解析了 RBM20 核内斑点和致病性胞质颗粒的蛋白组成，并发现 RBM20 胞质颗粒与 CELF1 、 MBNL2 等剪接因子相关联，同时伴随其下游靶基因的异常剪接。不同 RBM20 动物模型的比较进一步表明，这些剪接异常并非单纯由 RBM20 核内功能缺失所致，而可能与胞质颗粒的形成有关。该研究将 RBM20 心肌病的致病机制从传统的 “ 核内功能缺失 ” 拓展至 “ 胞质颗粒 介 导的获得性毒性作用 ” ，提示 RBM20 胞质颗粒可能通过影响其他剪接因子，扰乱更广泛的 RNA 剪接网络，为理解 RBM20 突变导致心肌病提供了新的机制视角。

威斯康星大学麦迪逊分校 张阳海 为论文第一作者， 过伟 为 通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag770

制版人：十一

参考文献

1. Nilsen TW, Graveley BR. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.Nature.2010 ;463 (7280):457-463. doi:10.1038/nature08909

2. Hasimbegovic E, Schweiger V, Kastner N, et al. Alternative Splicing in Cardiovascular Disease-A Survey of Recent Findings.Genes(Basel) . 2021 ;12 (9):1457. Published 2021 Sep 21. doi:10.3390/genes12091457

3. Guo W, Schafer S, Greaser ML, et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing.Nat Med.2012 ;18 (5):766-773. doi:10.1038/nm.2693

4. Li S, Guo W, Dewey CN, Greaser ML. Rbm20 regulates titin alternative splicing as a splicing repressor.Nucleic Acids Res.2013 ;41 (4):2659-2672. doi:10.1093/ nar /gks1362

5. Bertero A, Fields PA, Ramani V, et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory.NatCommun.2019 ;10 (1):1538. Published 2019 Apr 4. doi:10.1038/s41467-019-09483-5

6. Zhang Y, Gregorich ZR, Wang Y, et al. Disruption of the nuclear localization signal in RBM20 is causative in dilated cardiomyopathy.JCI Insight.2023 ;8 (13):e170001. Published 2023 Jul 10. doi:10.1172/jci.insight.170001

7. Methawasin M, Zhang Y, Gregorich ZR, et al. Reducing Granules Without Splicing Restoration Alleviates RBM20 Cardiomyopathy.CircRes.2025 ;136 (10):1134-1146. doi:10.1161/CIRCRESAHA.124.324781

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