Nat Commun | 谢安勇课题组揭示独立于53BP1的Shieldin-BRCA1拮抗新机制

背景

PARP 抑制剂（ PARPi ）通过合成致死效应选择性杀伤同源重组（ Homologous recombination ， HR ）缺陷的 BRCA1 突变肿瘤，是靶向 精准 治疗的 经典 范例。 传统 认知中， 53BP1 通过 结合 RIF1 、招募 下游 R EV 7-SHLD1-SHLD2-SHLD3 （ Shieldin ）复合 物 限制 DNA 双链断裂（ Double strand break ， DSB ）末端 切除 ，从而 拮抗 BRCA1 、 抑制 HR 并 维持 BRCA1 缺陷细胞的 PARPi 敏感性 。 换句话说， Shieldin 的生物学功能高度依赖上游 53BP1 ，二者共同构成 经典 53BP1‑Shieldin 调控轴【1, 2】。

然而多项研究提示该轴并 非 单一 的线性调控模式 。 例如， 53BP1 介导的 V(D)J 重组 、 基因组 稳定性维持以及 PTIP 依赖的末端切除抑制 不需要 Shieldin 参与【3-5】。 敲除 53BP1 可使 exon 11 缺失的 BRCA1 突变细胞产生 PARPi 耐药，但该现象在 BRCA1 coiled-coil （ CC ） 结构域、 exon 5‑13 或 BRCT 结构域缺失的细胞中 并不会发生【6-8】。 在 BRCT 结构域 缺失的 乳腺癌细胞系 HCC1937 中， 53BP1 缺失 也 不能 导致 PARPi 耐药【7】。这些 现象 提示， Shieldin 可能具备 独立 于 53BP1 的功能。更重要的是，团队先前发现， BRCA1 缺陷肿瘤的特征 性 突变模式源于 DNA 复制偶联单末端 DSB （ single-ended DSB ； seDSB ） 修复紊乱，而非传统认知 的 双末端 DSB （ double-ended DSB ； deDSB ） 修复异常【9】。在 复制偶联单末端 DSB 损伤 场景 下 ， Shieldin 能否绕过 53BP1 而 独立 调控 DSB 修复 是一个未回答的 核心科学问题 。

近日 ，浙江大学转化医学研究院 / 医学院附属邵逸夫医院谢安勇/蔡秀军/冯依力团队 在Nature Communications杂志上 正式 发表 了题为 5 3BP1-independent Shieldin-BRCA1 antagonism at replication-coupled double-strand breaks 的研究论文，系统回答了上述问题。

研究团队首先在 BRCA1 BRCT 结构域 缺失（ Brca1 ΔBT ） 的小鼠胚胎干细胞中，敲除 53bp1 和 Shld2 ，检测 PARPi 敏感性。结果 表明 仅有 Shld2 缺失显著 推动 PARPi （ Olaparib ） 耐药 形成， 且 Shld2 的功能可以不需要 53bp1 存在（图1a，b）。 Brca1 ΔBT /ΔBT 细胞中， Olaparib 诱导的辐射状 染色体 结构在 Shld2 缺失后明显减少， 但 53bp1 缺失不影响。 同时， 在 BRCA1 BRCT 缺失型的乳腺癌细胞 MDA‑MB436 中 ， 利用 siRNA 干扰或 CRISPR /Cas 9 敲除 Shld2 ， 而非 53bp1 ， 可促使细胞产生 PARPi 耐药。 反观 BRCA1 exon 11 缺失（ Brca1 Δ11 ）细胞， Shld2 或 53bp1 任一基因敲除 均可 推动耐药形成（图1a，c）。 以上 结果直接证实： BRCA1 BRCT 缺陷背景下， Shieldin 独立于 53BP1 维持 PARPi 敏感性。

图1. Shieldin独立于53BP1调控Brca1ΔBT/ΔBT细胞的PARPi敏感性。a. Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞中敲除53bp1和/或Shld2的WB检测结果。b. Shld2独立于53bp1调控Brca1ΔBT/ΔBT细胞的PARPi敏感性。c. 53bp1/Shld2轴调控Brca1Δ11/Δ11细胞的PARPi敏感性。

为 考察 Shieldin 能否独立于 53BP1 在 Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞中 调控 DSB 修复途径， 团队 借助 姊妹染色单体重组 SCR-RFP 报告系统 ， 分析 经典 de DSB （ Cas9 诱导） 与复制偶联 se DSB （ Cas9 D10A /Cas9 H840A 诱导） 的 HR 修复 效率 。 有趣的是 ， 53bp1 缺失显著恢复 deDSB 的 HR 效率 ， 对 s eDSB 的 HR 恢复作用 几乎没影响；而 Shld2 缺失 可以 特异性恢复 se DSB 的 HR 修复 水平（图2a）。 利用 Cas9 核酸酶 / 缺刻酶在 内源位点 诱导 deDSB 和 seDSB ， 进一步解析 非同源末端连接（ non-homologous end joining ； NHEJ ） 效率和接口 碱基增删（ insertion and deletion ； In d el ） 特征 。 结果表明，敲除 53bp1 或 Shld2 均不影响 Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞中 deDSB 的 NHEJ 效率 ，但 53bp1 缺失 或 Shld2 缺失 均 可 补救 突变细胞的末端 切除 缺陷（图2b，c）。对于复制偶联 seDSB ， 53bp1 缺失 基本不影响 BRCA1 缺陷细胞中上升的 NHEJ 效率 和 Indel 接口 删除 长度，但 Shld2 缺失 可 显著 降低 BRCA1 缺陷细胞中 NHEJ 效率 、 缩短 Indel 接口 删除 长度（图2b，c）。 与之形成对照 ，在 Brca1 Δ11/Δ11 细胞中， 53bp1 和 Shld2 任一 缺失均可恢复 seDSB 的 HR 效率，抑制 seDSB 的 NHEJ 效率 并缩短 In d el 接口 删除 长度（图2a-c）。这 表明在 BRCA1 BRCT 缺陷 下 ， Shieldin 可 独立于 53BP1 调控复制偶联 seDSB 的 修复 。

图2. Brca1ΔBT/ΔBT细胞中Shieldin独立于53BP1调控seDSB修复途径。a. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞HR修复影响。b. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞NHEJ修复影响。c. 敲除53bp1或Shld2对Brca1ΔBT/ΔBT和Brca1Δ11/Δ11细胞Indel接口删除长度影响。

上位效应实验 发现 ，独立于 53BP1 的 Shieldin 功能需要 通过 CST （ CTC1–STN1–TEN1 ）复合物实现 。 DNA 聚合酶 a 通常在 CST 下游支持 53BP1‑Shieldin 调控轴 的功能，但 抑制 DNA 聚合酶 a 活性 则不 影响 独立于 53BP1 的 Shieldin 功能 。 进一步分析发现： Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞中， Shld2 /Shld3 缺失 更 能 强有力 恢复 RAD51 焦点，即使在 53bp1 缺失背景下也 能发挥功能（图3）。 这提示 Shieldin 可能在没有 53BP1 的情况下也能结合末端并发挥作用。为了证明这一猜测，研究者 在 Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞 中构建了 ssDNA 结合 能力 缺陷的 SHLD2 ΔWFG 和 SHLD2 ΔOB1-3 内源 突变体【10】，这 两种突变均 产生 PARPi 耐药 并恢复 RAD51 加载功能 ，表型与 Shld2 敲除一致。 随后 ， 在敲除 Ctc1 的 Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞中回补 CTC1 及其突变体，进一步证实 CST 复合物及其 DNA 结合能力是 Shieldin 发挥独立功能的关键。 这表明 Shieldin -CST 可 通过其固有的 ssDNA 结合能力直接作用于已 加工的 DNA 末端，绕过 53BP1 的 招募。 为彻底排除 53BP1 的参与， 研究者 还 在 Brca1 ΔBT/ΔBT Shld3 –/– 细胞中 表达了三个破坏 53BP1/RIF1 结合的 SHLD3 点突变体（ R171A 、 W137A 、 D221A ），它们均能恢复 Brca1 ΔBT/ΔBT Shld3 –/– 细胞的 PARPi 敏感性 并破坏 RAD51 加载功能 ， 进一步证实 Shieldin 功能的 53BP1 独立性。

图3.Brca1ΔBT/ΔBT细胞中Shieldin独立于53BP1抑制RAD51加载功能

那么， 不依赖 53BP1 的 Shieldin 究竟 如何抑制 RAD51 加载 的呢 ？ BRCA1 缺陷细胞中， RNF168 可以帮助 RAD 51 加载 ，补偿 RAD 51 加载 的缺陷，然而， 通 过破坏 RNF168 的 RAD51 互作结构域，研究首先排除了 RNF168 作为 Shieldin 拮抗靶点的可能性。 BRCA1 蛋白缺乏 BRCT 结构域 后出现错误折叠并导致降解 ，但 残留的蛋白依旧 保留完整的 CC 结构域 —— 该结构域通过 PALB2-BRCA2 负责 加载 RAD51 ，是 RAD 51 加载 的主要途径【11】。 研究者 在 BRCA1 ΔBT 基础上进一步敲除 CC 结构域的关键基序 IKL 后， Shld2 缺失不再 能够 恢复 RAD51 焦点或赋予 PARPi 耐药（图4a-c）。 同样， 在 CC 结构域完全缺失的 Brca1 –/– （ exons 5-13 缺失 ）和 Brca1 ΔCC/ΔCC （ CC 结构域 缺失 ） 突变体 中，敲除 53bp1 或 Shld2 均无法恢复 RAD51 焦点或赋予耐药 ， 提示 CC 结构域完全缺失后， Shieldin 丧失了特异性拮抗靶点（图4a-b，d-e）。这表明 Brca1 ΔBT/ΔBT 细胞 中， 独立于 53BP1 的 Shieldin 特异性拮抗 靶点是 残余的 BRCA1 CC 结构域 活性 介导的 RAD51 加载途径 。 为了进一步验证该结论， 研究者构建了 Bard1 –/– 细胞， 该细胞中 BRCA1 因 无法与 BARD1 结合 而 发生 降解 ，但残留蛋白 仍 保留完整的 CC 结构域 。此时 Shld2 缺失依然赋予 PARPi 耐药 ，且 53bp1 缺失 没有影响 。 反观 缺失 RING 结构域的 BRCA1 （ Brca1 ΔRING ）细胞中 ， BRCA1 稳定而 BARD1 降解， 此时 53bp1 或 Shld2 缺失均可赋予耐药， 53BP1 非依赖 的 Shieldin 功能被 掩盖 。上述结果精细界定了 独立于 53BP1 的 Shieldin 功能发挥 的 前提： 仅当 细胞内存在残留的 BRCA1 CC 结构域介导的 RAD51 加载活性（ 即 BRCA1 水平低或不稳定）时， Shieldin 可 绕过 53BP1 进行有效拮抗。

图4.独立于53BP1的Shieldin拮抗残留的BRCA1 CC结构域介导的RAD51加载活性。a. 不同Brca1突变等位基因编码的BRCA1蛋白结构示意图。b. BRCA1突变体细胞中敲除53bp1或Shld2的WB检测结果。c-e. 敲除53bp1或Shld2对不同BRCA1突变体细胞药物敏感性的影响。

研究总结

该研究首次 系统揭示了 Shieldin 复合体不依赖于 53BP1 的独立功能，突破了 “Shieldin 仅是 53BP1 下游效应器 ” 的 传统 认知框架。 该研究核心发现证实： Shieldin 凭借 自身 和下游因子 CST 的 ssDNA 结合能力 ， 直接阻断残余 BRCA1 CC 结构域介导的 RAD51 加载 。该机制阐明了 不同 BRCA1 突变 体呈现 PARPi 耐药 差异 性的 分子基础 ， 也为 PARPi 的肿瘤个体化精准治疗提供了 一个 新的患者分层依据与干预策略。 在 BRCA1 BRCT 截短突变、 BARD1 缺失或 BRCA1 启动子高甲基化的肿瘤中， Shieldin 通路完整性可能成为更精准的 PARPi 疗效预测指标；而在 BRCA1 exon 11 缺失或 RING 结构域缺失的肿瘤中，经典 53BP1-Shieldin 轴仍是主导因素。

该研究依赖于 本团队于 2022 年建立的复制偶联 DSB 定点诱导及修复解析技术体系【9】。 这个 体系的建立 推动了该领域研究范式的革新 ， 已被国际同行广泛应用，极大深化了学界对复制偶联型 DSB 损伤修复机制的认知 ，也 帮助 团队 揭示 BRCA1 缺陷细胞特征性串联倍增（ tandem duplication ）形成的新机制【12】。

该论文通讯作者是浙江大学医学院附属邵逸夫医院和浙江大学转化医学研究院谢安勇教授 、 蔡秀军教授 和冯依力 副 研究员 。冯依力 副 研究员和王萌助理研究员是本文共同第一作者。 浙江大学医学院湖州医院董顺利研究员也 为本研究的开展提供重要支持 。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-74867-3

制版人：十一

参考文献

1. Setiaputra, D. & Durocher, D. Shieldin - the protector of DNA ends.EMBORep20 , e47560 (2019).

2. Mirman, Z. & de Lange, T. 53BP1: a DSB escort.Genes &Development34 , 7-23 (2020).

3. Ochs, F. et al. Stabilization of chromatin topology safeguards genome integrity.Nature574 , 571-574 (2019).

4. Vincendeau, E. et al. SHLD1 is dispensable for 53BP1-dependent V(D)J recombination but critical for productive class switch recombination.NatCommun13 , 3707 (2022).

5. Callen, E. et al. 53BP1 e nforces d istinct p re- and p ost-resection b locks on h omologous r ecombination.MolCell77 , 26-38 e27 (2020).

6. Nacson, J. et al. BRCA1 m utational c omplementation i nduces s ynthetic v iability.MolCell78 , 951-959 e6 (2020).

7. Nacson, J. et al. BRCA1 m utation- s pecific r esponses to 53BP1 l oss- i nduced h omologous r ecombination and PARP i nhibitor r esistance.CellRep24 , 3513-3527 e3517 (2018).

8. Chen, J.Y. et al. 53BP1 loss rescues embryonic lethality but not genomic instability of BRCA1 total knockout mice.Cell Death Differ27 , 2552-2567 (2020).

9. Feng, Y.L. et al. DNA nicks induce mutational signatures associated with BRCA1 deficiency.NatCommun13 , 4285 (2022).

10. Noordermeer, S.M. et al. The shieldin complex mediates 53BP1-dependent DNA repair.Nature560 , 117-121 (2018).

11. Chen, C.C. et al . Homology- d irected r epair and the r ole of BRCA1, BRCA2, and r elated p roteins in g enome i ntegrity and c ancer.Annu Rev Canc Biol2 , 313-336 (2018).

12. Huang, Z.C. et al. Late steps of allelic break-induced replication suppress tandem duplication associated with BRCA1 deficiency.NucleicAcidsRes53 , gkaf729 (2025).

（可上下滑动阅览）

学术合作组织

（*排名不分先后）

推荐直播

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘