浙江
短读长RNA-seq技术已在转录组研究中得到广泛应用，但其在可变剪接分析中的真实准确度以及如何达到最优性能，长期以来缺乏系统性的评估。2026年8月8日，国家临床检验中心张瑞研究员、李金明研究员与 复旦大学石乐明教授、郑媛婷研究员团队，在《自然·通讯》发表了题为“Benchmarking RNA-seq with the Quartet and MAQC reference materials to establish best practices for accurate alternative splicing analysis”的研究论文。该研究联合42家实验室和207条生物信息学分析流程，系统评估了短读长RNA-seq在可变剪接分析中的实际表现，并据此提出了实验设计和数据分析的最佳实践方案。
研究团队首先构建了基于Quartet和MAQC参考物质的多层次金标准数据集。Quartet参考数据集整合了七个批次的長读长RNA-seq数据和四条分析流程的结果，覆盖了10,218个转录本异构体和6,032个可变剪接事件。研究人员通过RT-qPCR对121个异构体和59个剪接事件进行了正交验证，证实了参考数据集与RT-qPCR结果在异构体水平上的Pearson相关系数达到0.95，在事件水平上达到0.76。混合样本T1和T2中已知的掺比比例则为评估异构体定量准确性提供了第三类独立的金标准。
在对42家实验室的实测数据进行分析后，研究团队发现数据质量和测序深度是决定可变剪接分析准确性的两个最关键因素。信噪比在基因水平、异构体水平和事件水平上分别为20.8、18.4和10.6，说明从基因分辨率推进到异构体和单个剪接事件分辨率时，定量准确性的挑战显著增加。测序深度与异构体定量的均方根误差呈显著负相关，高深度测序将注释 junctions的假阴性率从13.0%降至1.6%，但新型 junctions的假阴性率仍高达45.1%。在差异表达异构体鉴定中，高深度测序将召回率从0.005提升至0.61。
在实验流程方面，mRNA富集方法和链特异性是造成实验室间差异的主要来源，两者合计解释了异构体表达变异的42.3%和事件水平变异的32%。Poly(A)选择配合高深度测序的方案在异构体和事件水平的定量准确性上均表现最佳，采用rRNA depletion的两个实验室也因测序深度异常高而表现良好。在生物信息学流程方面，STAR和HISAT2作为比对工具表现优异，RSEM、eXpress和Cuffdiff在异构体定量中准确性更高，edgeR和NOISeq-real在差异表达分析中综合表现突出。对于事件级分析，SUPPA2在与Salmon、RSEM、Cuffdiff、Sailfish或Kallisto联用时表现最佳，rMATS和SUPPA2在事件级定量和差异剪接检测中表现较为均衡。
研究团队还发现异构体和剪接事件本身的生物学特征对检测准确性构成了系统性约束。高K值、短异构体、每个基因中异构体数量多、短外显子、高GC含量和低表达水平的异构体，其定量准确性普遍较差。在事件层面，临近剪接事件数量多、关联异构体数量少、高GC含量、低可比对性、中间PSI值以及关联异构体表达水平低的事件，其定量准确性也显著降低。上述特征反映了短读长RNA-seq在复杂转录本区域和低覆盖区域的固有局限。
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