浙江大学李承喜/上海有机所薛小松JACS：SuFEx酰氟化学突破肽环化“极稀释”依赖，100 mM仍实现97%单环选择性

导读

近日，浙江大学李承喜团队与中国科学院上海有机化学研究所薛小松团队合作，在 Journal of the American Chemical Society（JACS）发表研究论文，提出一种 SuFEx 赋能的酰氟活化策略，用于高浓度条件下的头尾肽宏环化。与传统依赖高稀释来压制分子间寡聚不同，该工作从“活化模式”本身入手，重新调节分子内闭环与分子间链增长之间的竞争关系。模型底物在 100 mM 条件下可得到 97% 环状单体，仅观察到 3% 环状二聚体，并获得 73% 分离收率；该策略还能拓展至多类肽序列、克级放大、固相环化及自动化合成流程。

环肽合成的老难题：浓度一高，分子就更容易“抱团”

头尾环肽因构象刚性更高、蛋白酶稳定性更好，并可获得优良的靶标结合能力，是药物发现和化学生物学中的重要分子类型。然而，头尾宏环化存在一个长期而基础的矛盾：目标反应是同一条肽链首尾之间的分子内酰胺键形成，但在常用偶联体系中，只要浓度升高，肽链之间的分子间反应就会迅速增强，进而产生线性或环状二聚体、三聚体乃至更高寡聚体。

因此，经典做法往往是“把体系稀释到足够低”，以统计学方式降低不同肽链彼此碰撞的概率。这个方法有效，却也直接带来低时空产率、大量溶剂消耗、放大困难，以及与高通量和自动化平台不匹配等问题。对于希望把环肽合成从毫克级研究工具推向规模化制造和快速药物发现的平台而言，“极稀释”本身就成为新的瓶颈。

图1 研究思路：传统头尾环化在高浓度下易发生分子间寡聚；本工作通过 SuFEx 原位酰氟活化，从反应活化模式层面提高分子内闭环倾向。

核心突破：不是继续稀释，而是从“活化模式”重写选择性

研究团队提出了一个不同于传统思路的问题：如果寡聚并非只能靠降低浓度来压制，那么能否通过改变羧酸的活化方式，让同一条肽链内部的闭环在动力学和热力学上更具优势？围绕这一设想，团队引入 SuFEx 介导的酰氟生成路径，在温和条件下原位形成酰氟中间体，以其“足够活泼但不过度活化”的反应特征重新平衡分子内与分子间酰胺键形成。

在模型肽 NH₂-AGPFL-COOH 上，研究者系统比较了多种酰氟形成体系和常规偶联试剂。优化后的 PhNTf₂/KF 体系配合 K₂CO₃、MeCN，可在 100 mM 高浓度下实现几乎完全的单环选择性：环状单体占 97%，环状二聚体仅 3%，未检测到更高寡聚体，目标环肽分离收率为 73%，同时未观察到可检测的差向异构化。

更具对比意义的是，在完全相同的 100 mM 浓度下，HATU、HBTU、HCTU、TBTU 和 PyAOP 等传统脲鎓/鏻鎓偶联体系均出现明显的二聚和更高寡聚，其中目标环状单体仅占约 32%–59%。换句话说，这项工作的关键并不是“找到一个更强的偶联试剂”，而是证明了不同的活化模式可以把宏环化反应导向完全不同的选择性结果。

图2 条件优化与化学选择性。模型底物在 100 mM 下得到 97% 环状单体和 3% 环状二聚体；传统偶联体系在相同高浓度下产生显著寡聚。

不仅能做模型底物：从五肽到十二肽，并推进到克级

为了验证方法的普适性，研究团队进一步考察了不同环尺寸、序列组成和官能团复杂度的肽底物。五肽、六肽、七肽、八肽以及九肽至十二肽均可实现有效环化，代表性天然环肽或类似物包括 Segetalin B、Phakellistatin 13、Hymenamide C 和 Gramicidin S 等。体系还兼容 L-正亮氨酸、炔基、叠氮基、香豆素荧光基团等非天然或功能化残基，并可用于侧链环化。

在放大实验中，研究团队将底物提升至 1 mmol 规模，在 50 mM 条件下进行溶液相宏环化，最终获得 0.97 g 目标环肽，分离收率 73%。对于宏环化而言，这一结果的重要性不仅在于“做到了接近克级”，更在于反应仍保持简单的产物组成和可操作的纯化过程，显示出高浓度策略在放大和制造层面的潜力。

图3 底物普适性与放大：覆盖不同环尺寸、非天然/功能化残基及侧链环化，并实现 1 mmol、50 mM 条件下 0.97 g 产物、73% 分离收率。

为什么有效？DFT显示 SuFEx 与 HATU 走上了两条不同的能量路径

研究团队进一步将实验与密度泛函理论（DFT）计算结合，以简化三肽 FPA 为模型解析选择性来源。在 SuFEx 酰氟通路中，关键酰氟中间体形成后，分子内闭环所需势垒低于竞争性二聚过程约 1.3 kcal/mol；与此同时，形成的环状产物逆向开环势垒达到 28.3 kcal/mol，使闭环在反应条件下接近不可逆。

HATU 路径则呈现相反趋势：其分子间二聚步骤的势垒比分子内环化低约 2.0 kcal/mol，而且进一步生成的二聚环状产物在热力学上明显更稳定。也就是说，两类体系并不是在“同一条路上快慢不同”，而是从活化中间体开始就塑造了不同的能量景观。这个结果为高浓度下为何出现截然不同的单环/寡聚选择性提供了机理依据。

图4 实验与 DFT 共同揭示选择性来源：SuFEx 酰氟通路在动力学上偏向分子内闭环，且环状产物逆开环势垒高；HATU 通路则更有利于二聚及后续寡聚。

从溶液到固相，再到自动化：反应被接入 CycloBot

一种有价值的环化反应，还需要能够进入真实的合成工作流。研究团队因此进一步验证了 SuFEx 酰氟化学与固相合成和自动化平台的兼容性。利用 Glu(OAll)/Lys(Alloc) 正交保护策略，7 肽和空间位阻更大的 13 肽均可直接在树脂上完成环化；其中 13 肽经 30 步合成后可获得 73% HPLC 收率和 68% 分离收率。

随后，团队将该反应整合到 CycloBot 自动化流动平台。系统通过固定化 KF 模块持续生成活性 SuFEx 试剂，并依次执行肽链延伸、酰化、正交脱保护和环化。以环肽 9a 为例，自动化流程将 HPLC 收率由手工操作的 57% 提升至 85%，四步处理总时间由 530 min 缩短至 60 min。作为对照，相同自动化条件下 HATU 树脂上环化的 HPLC 收率为 75%。这一结果说明 SuFEx 反应不仅能在烧瓶中成立，也能够被程序化、连续化地执行。

图5 固相与自动化合成。SuFEx 环化兼容树脂上操作与 CycloBot 自动化流程；以 9a 为例，自动化 HPLC 收率达 85%，四步总处理时间由 530 min 降至 60 min。

研究意义：把环化从“浓度控制”推进到“选择性工程”

这项工作的概念价值在于，它把头尾肽宏环化的解决思路从“通过极稀释减少分子间碰撞”，推进到“通过活化模式工程直接改变分子内/分子间反应的竞争关系”。当选择性能够在反应路径层面被设计，高浓度不再必然意味着严重寡聚，这为提高宏环化的时空效率、降低溶剂用量以及实现规模化制造提供了新的化学基础。

与此同时，该方法与固相合成和自动化平台的衔接，也使其价值超出单一反应开发：高选择性环化可以进一步成为自动化环肽合成、快速建库和药物发现流程中的一个可编程模块。对于正在快速发展的环肽药物、功能肽和自动化分子制造领域，这种“反应选择性设计 + 自动化执行”的组合具有较强的延展性。

论文信息

论文题目：SuFEx-Enabled Acyl Fluoride Chemistry for High-Concentration Minimal-Oligomerization Peptide Macrocyclization

发表期刊：Journal of the American Chemical Society (JACS)

DOI：10.1021/jacs.6c12217

共同第一作者：赵予晗、谢佩、王桐坤

共同通讯作者：薛小松（中国科学院上海有机化学研究所）、李承喜（浙江大学）

主要合作单位：浙江大学化学工程与生物工程学院、浙江大学杭州国际科创中心、中国科学院上海有机化学研究所。