巴恩斯迷宫 | HLA DP/DRA分子调节败血症相关脑病模型小鼠的全身炎症和神经炎症，加重认知功能障碍和长期焦虑

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脓毒症相关脑病（SAE）是脓毒症的一种严重且常见的神经系统并发症，其症状包括轻度意识模糊、谵妄、深度昏迷和严重认知功能障碍。 先前的流行病学和生物信息学研究表明HLA-DP和DRA分子在脓毒症过程中发挥着关键作用。 然而，这些II类分子导致SAE认知障碍的机制仍不清楚。 我们利用人源化转基因HLA-DP401/DRA-IAβ-/-基因型小鼠的腹膜污染和感染模型（PCI）模型，旨在研究HLA II类单倍型/等位基因对脓毒症的影响，并阐明导致认知障碍的潜在机制。

1.脓毒症患者大脑和HMC3细胞中HLA-DP/DRA表达升高

为了研究神经组织中HLA II分子 (HLA-DP/DRA) 的表达，我们分析了来自脓毒症患者的公开基因表达综合 (GEO) 数据。结果表明，大脑中HLA-DP和-DR分子的mRNA水平趋于上调（图1A-C）。我们进一步通过脂多糖 (LPS) 和干扰素 γ (IFN-γ ) 刺激人小胶质细胞克隆3细胞系 (HMC3)。与之前的报道一致，LPS/IFN-γ刺激迅速上调 HMC3 细胞中肿瘤坏死因子-α (TNFα)（图1D）、白细胞介素1β (IL-1β)（图1E）和白细胞介素6 (IL-6)（图1F）的表达。 同样，LPS/IFN-γ刺激的HMC3细胞中HLA-DPA1（图1G）和HLA-DRA（图1H）的表达也显著增加。

图1 脓毒症患者脑组织和HMC3细胞系中HLA DP和DRA表达上调。

2.HLA- DP/DRA 分子的引入导致实验性脓毒症死亡率增加和严重的临床症状

我们通过盲肠浆 (CS)注射在181只小鼠中诱导了严重的实验性脓毒症（图 2A）。 C57BL/6J和 HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI 小鼠一周内的总生存率相似，且均低于IAβ-/-PCI 小鼠（图2B、C）。该存活率与之前研究中报道的C57BL/6J PCI 小鼠的存活率一致。C57BL/6J和 HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI 小鼠表现出相当的中位累积3天 MSS 评分，两者均显著高于IAβ-/-(24.5) PCI 小鼠（图2D）。这些结果表明，内源性MHC II分子的丧失减轻了感染后的急性炎症，并且HLA II分子的引入部分逆转了内源性MHC II缺陷所赋予的炎症保护。

3.引入HLA-DP和HLA-DRA基因增强了脓毒症小鼠血清和海马中的炎症细胞因子反应

相应地，qPCR分析表明，HLA-DP和-DRA的引入不仅协同上调TNFα（图2H）和IL-1β（图2I）的mRNA水平，而且还增加了趋化因子Ccl-2（图2K）、Ccl-3（图2L）、Cxcl-10（图2M）和Cxcl-2（图2N）的海马表达。此外，CS注射升高了PCI小鼠中其他炎症因子的海马mRNA水平，包括IL-6（图2J）、G-csf（图2O）、Cxcl-9（图2P）、Cxcl-1（图2Q）、Lcn2（图2R）、Ccl-11（图2S）。这些发现与之前的研究一致，证明脓毒症期间血清和大脑中多种细胞因子 mRNA 同时上调。 总的来说，这些结果表明，小鼠 MHC II (IAβ) 的内源性缺陷减弱了感染后炎症反应，并且HLA-DP/DRA基因的引入部分逆转了 MHC II 类缺陷所赋予的这种抗炎作用。

图2 实验性脓毒症诱导血清和海马组织中细胞因子和趋化因子的显著

4.脓毒症诱导小胶质细胞激活和严重海马病理损伤

为了评估小胶质细胞的激活，我们用Iba1抗体进行免疫荧光染色（图3A）。 我们观察到PCI小鼠的小胶质细胞体大小（图3B）和免疫荧光强度（图3C）增加。在 C57BL/6J PCI 小鼠中也观察到绝对小胶质细胞计数增加，但在具有IAβ-/-背景的PCI小鼠中没有观察到（图3D），表明内源性MHC II类缺陷抑制了过度的小胶质细胞激活。

图3 海马组织的尼氏染色和TEM。

尼氏染色显示 HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI 小鼠神经元损伤仍然严重，细胞形态异常更明显，D14上CA1（图4B）和 CA3（图4C）区域尼氏体减少。 此外，TEM 分析显示 PCI 小鼠在 D14 时出现的线粒体肿胀、线粒体嵴破裂和线粒体基质空泡变化（图4D）。

为了研究病理变化，我们对PCI小鼠的海马组织进行了高尔基染色（图4E-H），结果显示与对照小鼠相比，PCI小鼠细胞体数量减少（图4F），第3天CA1区显著减少（图4G），树突轴断裂增加（图4H）。即使在第14天，具有IAβ-/-敲除背景的PCI小鼠CA1区域的细胞体和树突棘数量仍然减少（图4F-H）。

图4 脓毒症引起海马小胶质细胞激活和严重病理损伤。

5.整个海马体的转录谱模式揭示线粒体功能障碍

CS后三天，转录组分析在HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠中总共鉴定出1829个差异表达基因（DEG），远远高于C57BL/6J PCI小鼠和IAβ-/-PCI小鼠(图5A)。 与IAβ-/-PCI小鼠相比，HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI 小鼠有90个上调基因和274个下调基因（图5B），表明HLA转基因在IAβ-/-敲除背景下触发了独特且明显的基因表达重编程。KEGG通路分析显示，跟IAβ-/-与C57BL/6L PCI小鼠相比，SAE期间涉及“氧化磷酸化”和“活性氧”（图5D）。

总的来说，这些结果表明HLA-DP/DRA转基因可能主要通过调节线粒体能量代谢及其与免疫相关蛋白的相互作用来重塑感染后反应。

图5 PCI小鼠海马组织AMPK/mTOR信号通路的蛋白质印迹分析。

6.CS治疗能上调IAβ-/-小鼠中的AMPK-α磷酸化，但不上调HLA-DPDRA-IAβ-/-小鼠中的AMPK-α磷酸化

先前的研究表明 AMPK/mTOR 通路与脓毒症期间的认知障碍有关。因此，我们使用WB检查了CS治疗是否可以调节海马中的AMPK/mTOR通路（图6A-G）。如图6A所示，IAβ-/-PCI小鼠中AMPK-α磷酸化增加。相反，HLA-DP/DRA-IAβ-/-和WT PCI小鼠之间的AMPK-α磷酸化水平相似（图6A、D），表明HLA-DP/DRA分子的引入将AMPK-α磷酸化恢复至野生型水平。 PCI小鼠中mTOR磷酸化显著升高（图6F），而PCI小鼠中cleaved caspase3水平显著降低（图6G）。感染后caspase3表达的下调可能反映了生物体的代偿性抗凋亡反应。此外，CS治疗并没有明显改变nNOS（图6B）和eNOS（图6C）的表达水平。

图6 脓毒症在D14时诱发HLA-DP/DRA-IAβ-/-小鼠的神经认知功能障碍

7.脓毒症引起HLA-DP/DRA- IAβ-/-PCI小鼠的神经认知功能障碍和长期焦虑

CS诱导两周后（图7A），巴恩斯迷宫（BM）测试显示HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠需要更长的时间来定位目标孔（图7B、C），表明空间记忆受损。高架十字迷宫（EPM）测试显示，与WT PCI小鼠相比，HLA-DP/DRA-IAβ-/-和IAβ-/-PCI小鼠在开放臂中花费的时间更少，行进的距离更短（图7D、E），这表明具有IAβ-/-敲除背景的小鼠表现出明显的焦虑样行为。此外，旷场（OF）测试证实HLA-DP/DRA-IAβ-/-PCI小鼠仍然表现出焦虑样行为增加和空间探索减少（图7F，G），表明HLA-DP/DRA基因的引入可能加剧焦虑样行为并损害空间探索活动。

图7 SAE和 Kyoto基因以及KEGG通路分析期间海马组织的转录变化。

结论

简而言之，本文的研究强调了HLA II类通过调节全身和局部炎症细胞因子对细菌感染的反应，决定SAE结局中的主导作用。HLA转基因小鼠的这些结果与人类的生物信息学研究结果相似，并证实了HLA II类等位基因 (HLA-DP/DRA) 在控制脓毒症免疫反应强度方面的直接和主导作用。此外，HLA-DP/DRA-IAβ-/-小鼠代表了一种有前景的SAE模型，可实现治疗药物筛选和疗效评估以及感染机制的探索。

在该研究中，研究人员使用了赛昂斯巴恩斯迷宫（Sansbio，SA208）来进行实验操作。

作者提示: 个人观点，仅供参考

SA208 巴恩斯迷宫

Barnes巴恩斯迷宫由一个圆形平台构成，在平台的周边，布满了很多穿透平台的小洞。平台的直径、厚度以及洞口宽度根据实验动物不同而不同。洞口数目由实验者习惯而定，一般为10到30个。在其中一个洞的底部放置有一个盒子，作为实验动物的躲避场所；其它洞的底部是空的，试验动物无法进入其中。实验场所和其它迷宫实验场所类似，要求能给实验动物提供视觉参考物。实验方案根据实验者的习惯以及不同的实验要求而定，每次训练后都用70%的酒精进行清洗，并变换正确的洞口，但洞口的空间位置不变，以防止动物通过嗅觉而找到洞口。Barnes迷宫一般采用强光、噪声以及风吹等刺激作为实验动物进入躲避洞口的动机。