Phytomedicine (IF=11.3,TOP)｜从738种化合物中筛出茯苓酸A：靶向PPARγ激活AMPK抗细胞衰老，并协同重塑肠道菌群-代谢轴！(王晓波等团队)

2026年7月22日，大理大学健康科学中心基础医学院王晓波、周敏教授团队联合广西农业科学院微生物研究所吴小建教授团队，在Phytomedicine（中科院医学1区，TOP期刊，Impact Factor=11.3）在线发表题为“Poricoic Acid A Ameliorates Ulcerative Colitis via AMPK/PPARγ Pathway-Dependent Cellular Senescence Inhibition and Concomitant Gut Microbiota–Metabolome Modulation”的研究论文。该文于2026年5月6日投稿，7月10日修回，7月21日接收，并于7月22日在线发表。

该研究围绕溃疡性结肠炎（UC）中的肠上皮细胞衰老及肠道菌群-代谢紊乱展开。研究团队首先在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的NCM460结肠上皮细胞衰老模型中筛选了738种候选化合物，最终确定茯苓酸A（Poricoic acid A，PAA）为核心候选分子。随后，研究结合DSS诱导的小鼠结肠炎模型、网络药理学、转录组学、宏基因组学、靶向代谢组学、分子对接、细胞热迁移分析、药理学阻断及siRNA敲低等方法，对PAA的作用机制进行了系统验证。

研究发现，PAA可直接结合过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），并功能性激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/沉默信息调节因子1（SirT1）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）信号轴，从而抑制肠上皮细胞衰老及衰老相关分泌表型（SASP），减轻炎症并促进肠黏膜屏障修复。与此同时，PAA干预还与肠道菌群组成及代谢物谱的恢复密切相关，包括增加Akkermansia等潜在有益菌的丰度，以及恢复石胆酸和5-羟基吲哚乙酸等保护性代谢物水平。该研究从“宿主细胞衰老信号”和“肠腔菌群-代谢环境”两个层面，为PAA干预实验性溃疡性结肠炎提供了机制依据。

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【摘 要】

背景：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种难治性炎症性肠道疾病，主要表现为持续性肠道炎症和肠屏障完整性受损。其发病机制涉及肠道菌群失调、代谢功能紊乱及细胞衰老等多重因素。现有治疗方案仍存在局限，因此亟须开发能够同时干预上述相互关联病理过程的新型候选药物。

目的：本研究旨在评价茯苓酸A（Poricoic acid A，PAA）对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的肠上皮细胞衰老及小鼠溃疡性结肠炎的药理作用，并阐明其潜在分子机制。

方法：研究建立了DSS刺激的肠上皮细胞衰老模型和DSS诱导的小鼠UC模型。综合运用网络药理学、转录组学、肠道宏基因组学和肠道靶向代谢组学等多组学及生物信息学策略，并结合分子对接预测候选信号轴。随后通过药理学抑制剂阻断和siRNA介导的基因沉默实验，对核心信号通路进行功能验证。

结果：PAA显著抑制DSS诱导的肠上皮细胞衰老及炎症反应。动物实验表明，PAA可减轻DSS诱导的小鼠体重下降、直肠出血和结肠组织学损伤等UC相关表现。网络药理学与转录组学联合筛选显示，AMPK/PPARγ是介导PAA生物学作用的核心信号通路。

机制研究证实，PAA可直接结合并激活PPARγ，进一步功能性激活下游AMPK/SirT1/PGC1α信号。使用药理学抑制剂或siRNA阻断AMPK，可在很大程度上削弱PAA的抗细胞衰老和抗炎作用；抑制PPARγ则会继发性降低AMPK及其下游效应分子的活性。在小鼠模型中，抑制AMPK同样显著削弱了PAA对实验性UC的保护作用。此外，PAA干预与肠道菌群-代谢组轴的重塑及肠道稳态恢复密切相关。

结论：PAA可通过激活AMPK/PPARγ信号通路，在实验性UC模型中发挥抗细胞衰老、抗炎及结肠保护作用。上述作用还可能与肠道菌群-代谢组稳态的恢复有关。本研究确定了新的潜在分子靶点，并为PAA作为UC干预候选化合物的进一步研究提供了实验依据。

01

研究背景及科学问题

溃疡性结肠炎是一种持续存在且容易复发的肠道疾病，以肠黏膜弥漫性炎症和屏障损伤为主要特征，已成为日益突出的全球健康问题。目前，全球UC患者已超过500万，新兴工业化地区，特别是东亚地区的发病率正在快速上升。

UC患者常出现顽固性腹泻、黏液便或血便以及严重腹痛，对生活质量造成显著影响。尽管临床上已经应用5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）、糖皮质激素及生物制剂等药物，但仍有部分患者表现为原发性无应答，或在治疗过程中出现继发性疗效丧失。因此，开发能够提高持续缓解率并改善患者生活质量的新型干预策略仍具有重要意义。

近年来，肠黏膜微环境中的细胞衰老被认为是促进炎症持续加重和屏障修复失败的重要机制。细胞衰老是指细胞在氧化应激、DNA损伤或慢性炎症等因素作用下进入不可逆的细胞周期停滞状态，目前已被视为多种慢性炎症性疾病的重要病理驱动因素。

在持续性炎症刺激下，肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs）可进入永久性增殖停滞状态，并表现为P16INK4a、P21Cip1和P53等衰老标志物上调。衰老细胞不仅丧失正常的组织再生能力，还会通过衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）持续释放白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎介质。

这种“炎症性衰老”过程还可诱导邻近健康细胞发生继发性衰老，促进闭锁小带蛋白1（ZO-1）和闭合蛋白（Occludin）等肠道紧密连接蛋白降解，最终破坏肠屏障完整性。因此，抑制细胞衰老或调节SASP表达，可能成为突破现有UC治疗局限的重要方向。

肠道菌群-代谢组轴是连接宿主与外部环境的重要界面，在UC的发生和进展中具有核心作用。UC通常伴随肠道微生物多样性降低，尤其表现为具有黏膜修复能力的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）以及毛螺菌科中产丁酸菌群的丰度下降。

菌群失调可直接推动宿主代谢重编程，导致石胆酸（lithocholic acid，LCA）等次级胆汁酸以及5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindole-3-acetic acid，5-HIAA）等色氨酸衍生物减少。这些代谢物是激活PPARγ、芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AHR）及能量感应分子AMPK等宿主信号通路的重要内源性信号。恢复菌群-代谢物轴可能有助于减少肠毒性产物，通过代谢信号维持肠上皮细胞线粒体稳态，并阻断上皮细胞衰老程序。

茯苓是一种广泛使用的药食同源真菌。茯苓酸A是从茯苓菌核外层分离得到的主要活性三萜类成分。已有药理学研究表明，PAA具有抗炎、抗纤维化和代谢调节活性，并能够激活AMPK信号、减轻氧化应激相关组织损伤。此外，PAA还可能调节核受体PPARγ。然而，PAA对UC的作用及其具体分子机制此前仍缺乏系统研究。

本研究旨在明确细胞衰老是否参与UC的病理进程，并筛选具有抗衰老作用的候选化合物。研究团队首先建立DSS诱导的NCM460结肠上皮细胞衰老模型，并对包含738种候选分子的化合物库进行筛选，最终确定PAA为核心抗衰老候选分子。

随后，研究从细胞和动物层面评价PAA对DSS诱导的衰老与炎症的影响，并进一步验证UC伴随肠道过早衰老。研究还考察了PAA是否通过直接结合PPARγ，功能性激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴，并同时调节肠道菌群-代谢组稳态，从而为UC的抗细胞衰老干预提供潜在分子靶点和候选策略。

02

重要发现及亮点

茯苓酸A减轻DSS诱导的肠上皮细胞衰老和炎症

研究团队此前发现，DSS可诱导正常结肠上皮细胞发生衰老，其中3 μg/mL是诱导NCM460细胞衰老的适宜浓度。在此基础上，研究对包含738种化合物的候选分子库进行筛选，并将PAA确定为核心候选化合物。

衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色显示，PAA可剂量依赖性减少DSS诱导的SA-β-gal阳性细胞。细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测表明，当PAA浓度超过10 μM时，NCM460细胞活力明显下降。因此，研究选择8 μM作为后续细胞实验的干预浓度。

DSS连续处理3天后，细胞衰老标志蛋白P16和P21明显升高，而PAA可有效抑制上述变化。与此同时，PAA显著降低了DSS诱导的P65和P38磷酸化，提示核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）炎症通路受到抑制。

qPCR结果进一步显示，PAA逆转了衰老相关基因P21、P53以及促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的升高。DSS处理还引起经典DNA损伤标志物γ-H2AX随时间积聚，而PAA显著减轻了γ-H2AX异常表达，进一步支持其在体外抑制病理性细胞衰老和DNA损伤积累的作用。

图1：PAA减轻DSS诱导的正常肠上皮细胞衰老和炎症。（A）738种化合物的筛选及实验流程示意图。（B、D）不同浓度PAA对DSS诱导细胞SA-β-gal染色的影响，比例尺为50 μm；并对阳性细胞比例进行定量分析，n=4。（C）采用CCK-8法检测PAA对细胞活力的影响，n=4。（E—G）采用Western blot检测衰老相关蛋白P16和P21，并进行定量分析，n=3。（H—J）采用Western blot检测炎症相关蛋白p-P65/P65和p-P38/P38，并进行定量分析，n=3。（K—O）采用qPCR检测衰老标志物P21、P53以及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达，n=3。统计分析采用单因素方差分析，事后多重比较采用Tukey检验。ns表示差异无统计学意义；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

茯苓酸A减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎表型并修复肠屏障

在体外实验基础上，研究进一步建立DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型。雄性C57BL/6J小鼠连续7天饮用2.5% DSS，并分别给予PAA低剂量10 mg/kg/天、PAA高剂量20 mg/kg/天或阳性对照药5-ASA 100 mg/kg/天。

结果显示，PAA剂量依赖性减轻DSS诱导的体重下降、直肠出血和疾病活动指数（disease activity index，DAI）升高。其中，20 mg/kg/天PAA高剂量组的改善最为明显，在部分指标上的效果达到或超过5-ASA组。

形态学分析显示，高剂量PAA显著改善DSS造成的结肠缩短。组织病理学结果表明，PAA减轻了结肠黏膜损伤、隐窝破坏和炎症细胞浸润，并降低组织病理学评分。

Western blot结果显示，DSS显著降低结肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达，而PAA可恢复上述紧密连接蛋白水平。结肠组织原位免疫荧光进一步显示，对照组中三种紧密连接蛋白连续分布于肠上皮细胞边界；DSS处理使这种网状屏障结构明显断裂，并造成荧光信号减弱。PAA干预后，三种紧密连接蛋白的组织连续性及相对荧光强度均得到恢复。

图2：PAA减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状。（A）实验流程。（B）体重变化率，n=6。（C）粪便潜血指数（FOI），n=6。（D）疾病活动指数（DAI）评分，n=6。（E）各组结肠长度的代表性照片，n=3。（F）结肠长度的统计分析，n=6。（G）组织病理学评分，n=6。（H）结肠组织苏木精-伊红（H&E）染色代表性图像，比例尺分别为100 μm和200 μm。（J）结肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达。（I、K、L）对结肠组织中Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达进行定量分析，n=3。B、C、D采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验；F、G、I、K、L采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

茯苓酸A减轻DSS诱导的小鼠结肠细胞衰老和炎症

为验证细胞衰老与UC之间的关系，研究对不同组小鼠的完整结肠组织块及结肠冰冻切片进行SA-β-gal染色。DSS诱导后，结肠组织中出现大面积蓝色衰老阳性信号；PAA处理显著减少阳性染色面积，且高剂量组的效果更为明显。

Western blot和qPCR结果显示，PAA显著降低DSS诱导的P16、P21和P53过度表达。结肠组织免疫荧光检测发现，DSS模型组肠上皮内出现大量异常γ-H2AX焦点，表明DNA损伤明显增加；PAA干预可显著减少上述损伤信号，使其接近对照组水平。

Ki67染色结果显示，DSS显著抑制隐窝干细胞活性和上皮增殖修复能力，而PAA可提高Ki67阳性细胞比例。这表明PAA不仅降低衰老相关分子标志物，还可减轻体内DNA损伤，并重新激活受损结肠的增殖与组织修复程序。

考虑到SASP的促炎作用，研究进一步检测结肠炎症水平。PAA显著抑制P65和P38磷酸化，并降低IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达。5-ASA也表现出一定的抗衰老作用，进一步支持“细胞衰老-炎症”轴在UC发病过程中的重要性。

图3：PAA减轻DSS诱导的小鼠结肠细胞衰老和炎症。（A、B）结肠组织块SA-β-gal染色图像及定量分析，n=3。（C、D）结肠组织冰冻切片SA-β-gal染色图像及定量分析，n=3。（E—G）结肠组织中P16和P21蛋白的代表性免疫印迹图像及相对表达水平，n=3。（H—J）结肠样本中p-P65和p-P38蛋白的免疫印迹图像及相对表达水平，n=3。（K—O）结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、P21和P53的mRNA表达水平，n=3。统计分析采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

茯苓酸A干预与肠道菌群-代谢组轴恢复密切相关

研究采用宏基因组学分析PAA对结肠炎小鼠肠道菌群的影响。主坐标分析（PCoA）显示，DSS显著改变了肠道微生物群落结构，而PAA干预后，菌群组成整体向对照组方向恢复。

在α多样性方面，DSS使Chao1指数、ACE指数和观测物种数明显降低，提示物种丰富度和菌群复杂性受损；PAA显著逆转了这一趋势。

线性判别分析效应量（LEfSe）及线性判别分析（LDA）显示，PAA增加了拟杆菌门和厚壁菌门中多种潜在有益菌的丰度，其中包括具有黏膜修复作用的Akkermansia，以及Roseburia、Lachnospiraceae和Acetatifactor等产丁酸菌群。与此同时，PAA降低了潜在致病菌Desulfovibrio的丰度，可能有助于减少该菌产生的硫化氢所造成的肠道毒性。

宏基因组功能预测显示，DSS组中与细菌应激反应和转座活动相关的ABC转运蛋白、RecG解旋酶等基因明显上调。PAA则恢复了与多糖降解有关的己糖胺酶及SusD/RagB家族蛋白基因表达。KEGG富集分析显示，PAA相关变化主要涉及胆固醇代谢、色氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路。

靶向代谢组学分析进一步验证了菌群功能变化。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示，各组代谢谱明显分离，PAA组呈现向对照组恢复的趋势。在DSS诱导的差异代谢物中，有68种可被PAA显著逆转。

核心代谢物可分为三个功能模块。PPAR相关模块中，PAA恢复了LCA、异石胆酸（isolithocholic acid，isoLCA）及结合型鼠胆酸水平，这些分子可能作为FXR或PPARγ的内源性配体参与肠屏障稳态维持。

保护与修复模块中，PAA提高了5-HIAA和N-乙酰血清素等色氨酸代谢物水平，这些代谢物可与AHR信号及免疫调节相关。AMPK相关模块中，PAA提高了腺苷、肌酸和葡萄糖-6-磷酸等多种磷酸化糖的水平，为AMPK通路激活、细胞衰老抑制及组织修复提供了潜在代谢基础。

Spearman相关性分析显示，PAA富集的潜在有益菌群与上述保护性代谢物呈显著正相关，提示PAA干预、菌群-代谢组轴恢复及结肠炎改善之间可能存在联系。

图4：PAA干预与小鼠肠道菌群-代谢组轴的恢复密切相关。（A）基于LEfSe分析构建的系统发育分支图，显示Vehicle组、DSS组和PAA组之间具有显著差异的分类单元，分别以灰色、红色和蓝色表示。（B）基于Bray-Curtis距离构建的肠道菌群主坐标分析（PCoA）散点图，反映各组微生物群落结构的β多样性差异。（C）粪便代谢物的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）得分图，显示三组小鼠的代谢谱在空间上明显分离。（D）宏基因组预测功能基因热图，展示应激反应、转座活动和多糖代谢相关功能的主要差异。（E）差异代谢物KEGG通路富集分析气泡图，显示PAA主要调节的代谢通路。（F）关键差异代谢物热图，按照PPAR相关、保护与修复相关及AMPK相关三个功能模块进行分类，显示PAA对相关生物标志物的恢复作用。

网络药理学与转录组学共同指向AMPK/PPARγ通路

为进一步研究PAA调节细胞衰老和炎症的具体机制，研究首先通过网络药理学分析PAA干预UC的潜在靶点。数据库筛选得到76个PAA与UC的共同靶点。

蛋白质-蛋白质相互作用网络显示，Pparg、Sirt1、Pgc1a、Mtor和Tnf位于网络中心。GO分析表明，这些靶点主要参与炎症反应调节、上皮细胞生长及氧化应激反应；KEGG分析显示，潜在靶点显著富集于AMPK信号通路、PPAR信号通路及细胞衰老等过程。

为验证网络药理学预测结果，研究对各组小鼠结肠组织开展RNA测序。主成分分析显示，Vehicle组、DSS组和PAA组的转录表达谱明显分离，PAA组呈现向Vehicle组恢复的趋势。

PAA组与DSS组比较，共有1068个基因上调、953个基因下调。PAA干预显著恢复了紧密连接相关基因Ocln、Cldn3以及核受体基因Pparg的表达。

差异基因KEGG分析显示，PAA调节的基因主要富集于细胞衰老、氧化磷酸化、AMPK和PPAR信号通路。GO分析则涉及脂肪酸代谢、炎症反应调节和紧密连接恢复。基因集富集分析（GSEA）进一步显示，PAA显著激活AMPK和PPAR信号通路。

图5：网络药理学与转录组学整合分析揭示PAA的作用机制。（A）茯苓酸A（PAA）的化学结构。（B）预测靶点的KEGG通路富集分析，AMPK和PPAR核心通路以红色标示。（C）UC相关靶点与PAA靶基因的交集Venn图，共获得76个核心靶点。（D）各组小鼠结肠组织转录组表达谱的PCA散点图。（E—F）PAA组与DSS组（E）以及DSS组与Vehicle组（F）差异表达基因的火山图，并标注核心靶点Pparg、Ocln和Cldn3。（G）差异表达基因的KEGG通路富集分析。（H）差异表达基因的GO生物学过程富集分析。（I—J）AMPK信号通路（I）和PPAR信号通路（J）的GSEA富集图。

茯苓酸A直接结合PPARγ并激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴

分子对接显示，PAA对PPARγ和SirT1均具有较好的预测结合能力，结合能分别为−8.0 kcal/mol和−7.5 kcal/mol，并可与关键氨基酸残基形成稳定氢键。

PAA-PPARγ复合物的分子动力学模拟显示，在模拟后期，其均方根偏差稳定在约0.25 nm；均方根波动结果表明，结合口袋内氨基酸残基的柔性较低，提示PAA能够较稳定地锚定于PPARγ活性中心。吉布斯自由能、回转半径、溶剂可及表面积及氢键数量等分析同样支持复合物具有较为紧凑、稳定的构象。

细胞热迁移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）为PAA与PPARγ的物理结合提供了进一步证据。PAA处理使PPARγ的熔解温度由55.39 ℃升高至58.52 ℃，表明PAA增强了PPARγ的热稳定性。

相比之下，PAA与AMPK、SirT1或PGC1α之间未检测到显著物理结合，提示PPARγ可能是PAA的主要直接靶蛋白。在57 ℃固定变性温度下开展的等温剂量-反应CETSA显示，随着PAA浓度由2 μM升高至12 μM，受到热变性保护的PPARγ蛋白量明显增加，其半数有效浓度为7.210 μM，进一步支持PAA在细胞内直接、剂量依赖性地结合PPARγ。

在3 μg/mL DSS诱导的细胞模型中，AMPK磷酸化水平以及SirT1、PGC1α和PPARγ表达均明显下降。8 μM PAA干预可随时间逆转上述变化，处理3天时的恢复最为明显。

小鼠结肠组织中的结果与细胞实验基本一致。DSS破坏了AMPK-SirT1-PGC1α-PPARγ信号轴，而PAA可提高p-AMPK/AMPK比值，并恢复SirT1、PGC1α和PPARγ表达。上述结果提示，PAA可能通过“单一靶点结合、整条通路响应”的方式，直接作用于PPARγ并功能性激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴。

图6：PAA通过AMPK/PPARγ信号轴发挥作用的靶点鉴定与机制验证。（A）PAA与PPARγ的分子对接模型及详细氢键相互作用。（B—C）PAA-PPARγ复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的均方根偏差（RMSD，B）及蛋白质残基均方根波动（RMSF，C）轨迹。（D—E）采用CETSA验证PAA与PPARγ的结合，包括免疫印迹条带（D）和热熔解曲线（E），n=3。（F—K）细胞水平Western blot验证：检测PAA对DSS处理细胞中p-AMPK和PPARγ表达（F—H）以及SirT1和PGC1α表达（I—K）的影响，n=3。（L—Q）动物水平Western blot验证：检测PAA对DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中该信号轴各蛋白表达的恢复作用，n≥3。E中的统计分析采用非线性拟合程序中的Boltzmann双参数S形模型，精确计算熔解温度（Tm）；其余比较均采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

阻断AMPK削弱茯苓酸A的抗细胞衰老和抗炎作用

为判断PAA对肠上皮损伤的保护作用是否依赖AMPK通路，研究使用AMPK抑制剂Compound C（CC）处理NCM460细胞。

SA-β-gal染色显示，随着CC浓度升高，PAA对DSS诱导细胞衰老的抑制作用逐渐减弱。3 μM CC可显著增加SA-β-gal阳性细胞比例，使其接近DSS模型组水平。CCK-8检测显示，3 μM CC对细胞活力影响较小，而5 μM时细胞活力已明显下降，因此后续实验采用3 μM CC。

PAA可恢复DSS抑制的p-AMPK、SirT1、PGC1α和PPARγ表达。CC阻断AMPK后，PAA对AMPK磷酸化的促进作用明显减弱，并伴随SirT1、PGC1α和PPARγ继发性下降。

PAA还可降低炎症相关蛋白P65和P38的磷酸化水平，但加入CC后，炎症信号重新激活。与此同时，AMPK阻断显著削弱PAA对P16和P21的抑制作用，使两种衰老标志蛋白再次升高。

图7：药理学阻断AMPK通路削弱PAA在NCM460细胞中的抗细胞衰老和抗炎作用。（A—B）NCM460细胞SA-β-gal染色代表性图像（A）及阳性细胞比例定量分析（B），显示不同浓度Compound C（CC，0～10 μM）可剂量依赖性逆转PAA对DSS诱导细胞衰老的抑制作用，比例尺为50 μm，n=4。（C）采用CCK-8法评价不同浓度CC处理后的细胞活力，以确定适宜的无明显毒性阻断浓度，n=4。（D—G）采用Western blot检测各组核心信号蛋白及其磷酸化水平，包括AMPK-SirT1-PGC1α-PPARγ信号轴成员（D、E）、炎症通路标志物p-P65和p-P38（F），以及细胞衰老标志物P16和P21（G）。（H—O）对相应Western blot条带进行灰度定量分析，n=3。统计分析采用普通单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

阻断PPARγ及基因敲低进一步验证AMPK/PPARγ信号轴的必要性

为判断PAA的作用是否依赖PPARγ激活，研究使用PPARγ特异性拮抗剂GW9662（GW）。SA-β-gal染色显示，GW可剂量依赖性削弱PAA对DSS诱导细胞衰老的抑制作用。当GW浓度达到10 μM时，SA-β-gal阳性细胞比例显著升高，PAA的保护作用大部分被抵消。

CCK-8结果显示，10 μM GW对细胞活力没有显著不良影响，而15～20 μM GW可明显降低细胞活力。因此，研究选择10 μM作为后续阻断实验浓度。

Western blot显示，PAA可恢复DSS造成的PPARγ、p-AMPK、SirT1和PGC1α下降。GW阻断后，不仅PPARγ表达受到抑制，p-AMPK、SirT1和PGC1α也同步降低，支持PPARγ与AMPK通路之间可能存在正向信号反馈。

GW还可重新激活被PAA抑制的p-P65和p-P38，并使P16、P21再次升高。在转录水平，CC和GW均可逆转PAA对IL-1β、TNF-α和P21表达的抑制，提示这些指标的调节依赖完整的AMPK/PPARγ信号轴。

值得注意的是，阻断PPARγ后，IL-6和P53的mRNA水平并未显著回升；阻断AMPK则可明显逆转PAA对两者的抑制作用。这提示IL-6和P53可能更多受到AMPK分支直接调控，或PAA通过AMPK产生的部分抗炎和抗衰老作用并不完全依赖PPARγ。

为排除化学抑制剂潜在脱靶作用，研究进一步采用siRNA分别敲低AMPKα1（si-PRKAA1）和PPARγ（si-PPARG）。敲低任一靶点均显著削弱PAA对DSS诱导细胞衰老的保护作用，使SA-β-gal阳性细胞比例、P16和P21表达以及p-P38、p-P65炎症信号重新升高。

qPCR显示，敲低PPARγ可明显逆转PAA对IL-1β、IL-6、TNF-α及P21转录的抑制。敲低AMPKα1则显著恢复IL-1β和P21表达，但对IL-6和TNF-α mRNA的逆转未达到统计学显著性。这些结果进一步支持PAA的抗衰老和抗炎作用高度依赖AMPK/PPARγ信号轴，同时提示不同下游细胞因子的转录调节可能存在分支差异。

图8：药理学阻断PPARγ通路削弱PAA对NCM460细胞的保护作用。（A—B）NCM460细胞SA-β-gal染色代表性图像及阳性细胞比例定量分析，显示不同浓度GW9662（GW，0～20 μM）对PAA作用的逆转，n=4。（C）采用CCK-8法检测不同浓度GW处理后的细胞活力，以确定适宜的无明显毒性浓度，n=4。（D—G）采用Western blot检测各组PPARγ、p-AMPK、SirT1和PGC1α蛋白水平（D、E），炎症通路标志物p-P65和p-P38（F），以及衰老标志物P16和P21（G）。（H—O）对相应Western blot条带进行灰度定量分析，n=3。（P—T）采用qPCR检测各组细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及衰老相关基因P21和P53的相对mRNA表达水平，并显示CC或GW阻断后的变化，n=3。所有统计分析均采用普通单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

治疗性给药条件下PAA仍可减轻实验性结肠炎

为更接近疾病发生后再开始干预的治疗场景，研究建立了延迟给药模型，即在DSS连续造成3天肠道损伤后才开始给予PAA。

即使在疾病表型已经出现后开始干预，PAA仍可显著减轻DSS诱导的快速体重下降、粪便潜血增加和DAI恶化，并改善结肠缩短、黏膜溃疡、隐窝破坏和炎症细胞浸润，降低组织病理学评分。上述结果表明，在该动物模型中，PAA在活动性结肠炎阶段仍表现出一定的组织保护和修复作用。

AMPK阻断可逆转茯苓酸A在小鼠中的保护作用

为进一步验证PAA在体内的作用是否依赖AMPK通路，研究在动物实验中加入AMPK抑制剂CC，给药剂量为10 mg/kg/天。

PAA显著减轻DSS诱导的小鼠体重下降、粪便潜血和DAI升高；加入CC后，上述改善明显减弱。PAA可恢复DSS引起的结肠缩短，而CC处理后结肠长度再次下降。

H&E染色显示，PAA可减轻结肠黏膜损伤、隐窝破坏和炎症浸润，但AMPK阻断后，这些保护作用明显减弱，组织病理学评分重新升高。

完整结肠组织块和冰冻切片的SA-β-gal染色显示，PAA可减少结肠衰老阳性细胞，而CC显著抑制这一作用，使SA-β-gal阳性面积再次增加。

分子检测显示，PAA提高结肠组织中p-AMPK、SirT1、PGC1α和PPARγ的表达。CC不仅抑制AMPK磷酸化，还导致SirT1、PGC1α和PPARγ继发性下降。PAA对IL-1β、IL-6、TNF-α以及P21、P53转录的抑制，在AMPK阻断后也呈现明显减弱趋势。

图9：药理学阻断AMPK通路逆转PAA对DSS诱导结肠炎小鼠的干预作用。（A）基于AMPK抑制剂Compound C（CC）的动物实验设计示意图。（B—D）各组小鼠体重变化率曲线、粪便潜血指数及每日疾病活动指数（DAI）评分，n=6。（E—F）各组结肠的大体形态代表性图像及结肠长度定量分析，n=6。（G—H）各组结肠组织H&E染色代表性图像及相应组织病理学评分，n=6。（I—K）采用Western blot检测小鼠结肠组织中p-AMPK和PPARγ的表达，并进行相应灰度定量分析，n=3。B—D采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验；F、H、J、K采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

机制示意图总结

综合细胞实验、动物实验、多组学分析、靶点结合验证及通路阻断实验，研究提出了PAA改善DSS诱导实验性UC的作用模式。

DSS处理导致肠道菌群失调，潜在致病菌Desulfovibrio富集，而LCA和5-HIAA等保护性代谢物下降。上述肠腔环境变化伴随肠上皮细胞严重衰老、ZO-1、Occludin和Claudin-1等紧密连接蛋白下调，以及AMPK-PPARγ信号轴失活，最终造成黏膜屏障破坏和炎症持续。

PAA干预与Akkermansia等潜在有益菌丰度恢复以及LCA、5-HIAA等内源性代谢物升高相关。同时，PAA可直接结合PPARγ，并功能性激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴，抑制衰老相关基因表达，降低NF-κB和MAPK通路磷酸化，减少SASP产生，最终促进紧密连接蛋白恢复和肠黏膜屏障重建。

图10：PAA改善DSS诱导溃疡性结肠炎的机制示意图。在DSS诱导的小鼠UC模型中，肠道菌群发生失调，潜在致病菌Desulfovibrio显著富集，而保护性代谢物石胆酸（LCA）和5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）水平下降。上述环境变化诱导肠上皮细胞发生严重衰老，并伴随紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1下调以及AMPK-PPARγ信号轴失活，最终导致黏膜屏障破坏和炎症持续。PAA干预与Akkermansia等潜在有益菌丰度恢复以及内源性配体LCA和5-HIAA水平升高相关，共同支持肠道稳态的重建。此外，PAA可直接结合PPARγ，并功能性激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴。该信号级联反应可抑制衰老相关基因表达，降低NF-κB和MAPK通路的磷酸化，从而减少衰老相关分泌表型（SASP）的产生。上述作用共同促进紧密连接蛋白恢复及肠黏膜屏障重建。

【贡献】★★★★★

综上，PAA可直接结合PPARγ，并功能性激活AMPK/SirT1/PGC1α信号轴，从而抑制肠上皮细胞衰老及SASP分泌。与此同时，PAA干预伴随肠道微生物群落和代谢谱向有利方向调整，为受损肠黏膜提供更适宜的局部微环境。

本研究加深了对UC发病过程中“细胞内衰老-肠腔菌群失调”相互作用的认识。研究结果提示，PAA可作为抗细胞衰老和UC干预的候选化合物，具有进一步开展药效、安全性及临床转化研究的潜力。目前相关结论主要来自细胞和小鼠模型，仍需更多临床前研究及人体研究加以验证。

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