FSHW | 基于肽组学与宏基因组学揭示发酵蚕豆酱中鲜味肽的形成机制

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Abstract

鲜味肽在发酵蚕豆酱（fermented broad bean paste，FBBP）的风味形成中起着重要作用，而微生物产生的蛋白酶是鲜味肽生成的关键因素。为揭示FBBP自然发酵过程中鲜味肽的形成规律及其与产蛋白酶微生物之间的关系，本研究采用肽组学结合虚拟筛选技术对鲜味肽进行鉴定与筛选；同时，利用宏基因组学分析FBBP发酵过程中微生物来源蛋白酶基因的丰度变化。进一步基于Pearson相关系数，构建了各产蛋白酶微生物与鲜味肽之间的相关性网络图。

结果表明，在FBBP中共注释到2种外肽酶和4种内肽酶，其中Staphylococcus、Lactobacillus、Aspergillus和Weissella是主要的蛋白酶产生菌属。Lactobacilluscurvatus、Dyellajiangningensis、Erythrobacter sp.以及未分类的Pantoea属（unclassified_g_Pantoea）与鲜味肽表现出较强的相关性，可能在蛋白质水解并生成鲜味肽的过程中发挥重要作用。

本研究有助于阐明FBBP中鲜味肽的形成机制，加深对蛋白酶、微生物群落与核心鲜味肽之间关系的理解，为发酵过程中提升郫县豆瓣酱的鲜味品质提供理论依据。

Introduction

郫县豆瓣酱（Pixian Douban paste，PDBP）是中国最受欢迎的调味品之一，也是川菜不可或缺的基础调料。其以辣椒和蚕豆酱按一定比例配制，并经发酵酿制而成。其中，蚕豆酱的发酵过程是决定郫县豆瓣酱风味和品质的关键环节。发酵蚕豆酱（FBBP）以蚕豆和小麦粉为主要原料，在微生物代谢产生的酶作用下，被分解生成风味肽、风味氨基酸、单糖以及酸、醇、酯等多种挥发性风味物质。近年来，鲜味肽因其良好的口感特性和较高的营养价值而受到广泛关注，是风味的重要组成部分。

发酵过程中，微生物代谢（如蛋白水解和脂类水解）决定了风味物质的种类和含量，微生物群落在原料降解和风味形成中发挥着不可替代的作用。其中，微生物产生的蛋白酶通过催化蛋白质水解生成鲜味肽。然而，目前关于蚕豆发酵过程中鲜味肽的变化及其产蛋白酶微生物之间的关系仍缺乏系统研究。

因此，本研究结合肽组学与虚拟筛选技术鉴定FBBP中的鲜味肽，并利用宏基因组学分析发酵过程中微生物来源蛋白酶基因的丰度变化，进一步通过相关性分析揭示鲜味肽、蛋白酶及微生物来源之间的关系，为提升发酵蚕豆酱及郫县豆瓣酱的鲜味品质提供理论依据。

Results and Discussion

肽的鉴定

鲜味肽的筛选

肽的味觉特性与其氨基酸组成、排列顺序及分子量密切相关。已有研究表明，鲜味肽多为小分子肽，尤其是分子量低于1000 Da的肽通常具有较强的鲜味特性。鲜味肽中常富含天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q），这些氨基酸及其组合被认为是鲜味形成的重要结构基础。

基于上述特征，本研究以分子量＜1000 Da且D、E、N、Q含量≥30%为筛选标准，从FBBP中共筛选得到377条游离肽。主成分分析结果显示，随着发酵时间延长，各组之间差异逐渐增大，其中D90组与其他组差异最为显著，而D0与D30组差异相对较小（图1a）。不同发酵阶段肽的数量随发酵时间明显增加，D0、D30、D60和D90组分别检测到98、161、250和352条肽，其中D60与D90组具有较多共有肽（图1b）。肽的分子量主要集中在0.25～0.5 kDa区间，且各分子量区间的肽数量均随发酵时间增加而上升（图1c）。

进一步结合iUmami-SCM与PeptideRanker进行虚拟筛选，最终共鉴定出269条潜在鲜味肽，其丰度变化如图2所示。结果表明，与未发酵组相比，发酵组中鲜味肽丰度显著提高，且随发酵时间延长呈上升趋势。预测结果显示，该筛选方法的准确率为71.35%，表明肽组学结合虚拟筛选在鲜味肽筛选中具有较高的可靠性。

图1 不同发酵时间FBBP中鲜味肽的鉴定

图2 不同发酵时间鲜味肽的热图分析

筛选鲜味肽的组成特征

为进一步明确鲜味肽的结构特征，对其氨基酸组成进行了分析。结果显示，筛选得到的鲜味肽以短肽为主，其中三肽占比最高，其次为四肽和二肽（图3a），与已报道的多种食品体系中鲜味肽的组成特征一致。

氨基酸组成分析表明，D和E在鲜味肽中出现频率最高，其次为L、N、V、P、A、S和G（图3b）。已有研究表明，除D、E、N、Q外，V、P及甜味氨基酸（A、S、G）亦可协同增强肽的鲜味特性，这可能是这些肽具有鲜味的重要原因之一。此外，N端和C端氨基酸分析结果显示，D和E均为主要末端氨基酸残基（图3c）。部分肽同时具有酸性氨基酸与碱性氨基酸的特定末端组合结构，该结构在以往研究中已被证实与较强鲜味特性相关。

图3 筛选得到的鲜味肽组成分析

FBBP中的微生物蛋白酶

FBBP中蛋白酶的类型与分布

鲜味肽是FBBP风味的重要组成部分，而微生物蛋白酶是其生成的关键催化因素。宏基因组学分析显示，FBBP中共注释到来源于39个微生物属的多种蛋白酶基因，主要包括外肽酶和内肽酶。外肽酶主要为氨肽酶和羧肽酶，内肽酶则包括丝氨酸内肽酶、金属内肽酶、天冬氨酸内肽酶和半胱氨酸内肽酶。

不同发酵阶段蛋白酶基因丰度变化如图4所示。结果表明，发酵后期（D90）氨肽酶、羧肽酶和丝氨酸内肽酶为主要蛋白酶类型，其丰度分别占总蛋白酶含量的较大比例。蛋白酶丰度随发酵时间呈先下降后上升趋势，并在D90达到峰值，该变化趋势与产蛋白酶微生物丰度变化基本一致（图5）。

图4 不同发酵时间蛋白酶的变化情况

外肽酶和内肽酶的微生物来源

氨肽酶和羧肽酶主要由Staphylococcus、Lactobacillus、Weissella、Bacillus_f__Bacillaceae等属微生物产生（图5）。内肽酶中，丝氨酸内肽酶和金属内肽酶分布最为广泛，主要由Staphylococcus、Lactobacillus、Aspergillus和Weissella等属产生。综合分析表明，上述微生物属是FBBP中蛋白酶的主要来源，同时也是郫县豆瓣酱发酵过程中占优势的核心微生物。

图5 D0、D30、D60和D90组中不同蛋白酶微生物来源丰度的变化

FBBP鲜味肽与蛋白酶的相关性分析

选取筛选后丰度排名前50的鲜味肽作为FBBP的核心鲜味肽，与主要产蛋白酶微生物进行Pearson相关性分析（图6），并进一步构建相关性网络图（图7）。结果显示，多种产蛋白酶微生物与鲜味肽之间存在显著正相关关系。其中，Lactobacillus curvatus、Dyella jiangningensis、Erythrobacter sp.及unclassified_g__Pantoea与鲜味肽的相关性最强，表明这些微生物可能在核心鲜味肽的生成过程中发挥关键作用。

图6 核心鲜味肽与丰度排名前50的产酶微生物物种相关性聚类热图

图7 核心鲜味肽与产酶物种的相关性网络图

Conclusion

本研究基于肽组学与虚拟筛选技术，从 FBBP 中系统鉴定了鲜味肽，并结合宏基因组学分析揭示了其形成过程中微生物蛋白酶的作用机制。结果表明，FBBP中富含多种微生物来源的蛋白酶，其中氨肽酶、羧肽酶和丝氨酸内肽酶是鲜味肽形成的主要酶类。相关性分析显示，24种产蛋白酶微生物与鲜味肽显著相关，其中L. curvatus、D. jiangningensis、Erythrobacter sp.和unclassified_g__Pantoea可能是FBBP核心鲜味肽形成的关键功能菌群。本研究为阐明FBBP鲜味肽的形成机制及优化郫县豆瓣酱发酵风味提供了理论依据。

Revealing the formation mechanism of umami peptides in fermented broad bean paste based on peptidomics and macrogenomics

Yuqing Xiea, Jianhua Zhaoa, Binbin Zhoua, Ping Liuc, Jie Zhaob, Min Xuc, Jiaxin Chenc, Hongbin Lina,b,*, Jie Tangc,*

a School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China

b Food Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610039, China

c Chongqing Key Laboratory of Specialty Food Co-built by Sichuan and Chongqing, Chengdu 610039, China

*Corresponding author.

Abstract

Umami peptides play important roles in the flavor of fermented broad bean paste (FBBP), and proteases produced by microorganisms contributed to the production of umami peptides. In order to reveal the formation of umami peptides and their relationships with protease-producing microorganisms during the natural fermentation of FBBP, peptidomics and virtual screening were used to identify and screen umami peptides. Meanwhile, macrogenomics was used to analyze the abundance of microbial-derived protease genes during FBBP fermentation. Then, based on the Pearson correlation coefficient, the correlation network diagram of each protease-producing microorganism with umami peptides was constructed. The results showed that a total of two exopeptidases and four endopeptidases were annotated from FBBP. Staphylococcus, Lactobacillus, Aspergillus, and Weissella can produce most proteases. The species Lactobacillus curvatus, Dyella jiangningensis, Erythrobacter sp., and unclassified_g_Pantoea had strong correlation with umami peptides, and they may contribute to the process of protein hydrolysis to produce umami peptides. This study is expected to reveal the formation mechanism of umami peptides in FBBP, and the results of this study provided a better understanding of the relationship between proteases, microbiota, and core umami peptides in FBBP, which could help to improve the umami taste of Pixian Douban paste during fermentation.

Reference:

XIE Y Q, ZHAO J H, ZHOU B B, et al. Revealing the formation mechanism of umami peptides in fermented broad bean paste based on peptidomics and macrogenomics[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250296. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250296.

翻译：王小云（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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