北京
在生物制药和化药研发领域，理解候选分子与靶标蛋白之间的相互作用特性，是指导药物设计和优化结构的关键环节。除了表面等离子共振（SPR）等经典技术外，近年来以微量热泳动（MicroScale Thermophoresis，MST）和纳米差示扫描荧光法（nano Differential Scanning Fluorimetry，nanoDSF）为代表的新型生物物理检测技术，凭借其低样品消耗、快速检测和对样品纯度要求相对宽松等独特优势，正在获得越来越广泛的应用。这些技术为研究者提供了互补性的分子互作信息，尤其适合处理传统方法难以应对的复杂样品体系。
MST微量热泳动：基于温度梯度的分子互作新视角
微量热泳动是一种基于温度梯度下分子定向运动（热泳动效应）的互作检测技术。当红外激光在毛细管中形成微尺度温度梯度时，溶液中的分子会受到热泳动力的驱动，沿温度梯度方向发生浓度重分布。分子的热泳动特征与其水合层、电荷分布及大小密切相关，而当两个分子发生结合时，这些物理化学性质会随之改变，从而表现为热泳动信号的偏移。
在实验操作中，通常将其中一种互作分子进行荧光标记（如使用GFP融合蛋白或荧光染料），另一种分子则以系列浓度梯度加入。通过监测荧光强度随温度梯度的变化，仪器可自动计算各浓度条件下的热泳动曲线，并拟合出结合曲线以获得KD值。MST技术的一个突出优势是其对样品基质的高耐受性，可直接在细胞裂解液、血清甚至脂质体环境中进行检测，无需对蛋白进行复杂的纯化过程。这一特点使其特别适用于膜蛋白、内在无序蛋白（IDPs）等难以纯化样品的互作研究。
此外，Monolith系列MST仪器近年来引入了基于温度相关强度变化（TRIC，Temperature-Related Intensity Change）的新型检测模式，进一步拓展了可检测的分子量范围和样品类型。国内已有CRO机构将MST-TRIC技术整合入其生物物理检测服务体系，为不同类型的分子互作项目提供灵活的技术选择。
nanoDSF热稳定性分析：从蛋白构象稳定性到配体结合验证
蛋白质的热稳定性是反映其构象完整性和功能活性的重要指标。差示扫描荧光法（DSF）通过监测荧光染料（如SYPRO Orange）与解折叠蛋白暴露疏水区域的结合信号，来测定蛋白的解链温度（Tm）。传统DSF方法受限于染料本身对特定缓冲成分（如去垢剂）的敏感性。nanoDSF技术则利用色氨酸等内源性荧光基团在蛋白折叠态与解折叠态下量子产率的变化，无需外源性染料即可精确测定Tm值。
在药物发现实践中，nanoDSF常被用于两个核心场景：一是评估蛋白样品的质量和储存稳定性，筛选最优表达条件和缓冲体系；二是检测小分子配体与靶蛋白结合后引起的热稳定性偏移（Thermal Shift Assay，TSA）。当配体与蛋白结合形成稳定复合物时，通常会提高蛋白的解链温度（ΔTm），这一效应与配体的结合亲和力呈正相关。通过高通量筛选大量化合物库并测定各自的ΔTm，研究人员可以快速识别与靶蛋白存在相互作用的苗头化合物。
Prometheus系列nanoDSF仪器（NanoTemper Technologies）是目前该领域的主流设备，可在数分钟内完成单个样品的Tm测定，且仅需微升级别的蛋白样品。国内部分生物技术服务机构已将该技术纳入其常规检测菜单，并与热位移分析（TSA）、光谱位移（SpS）等技术相结合，构建起多层次的热稳定性评价平台。
生物物理检测技术的整合应用与互补策略
在实际的药物发现项目中，单一检测技术往往难以全面回答所有科学问题。MST和nanoDSF的优势在于样品需求量低、实验操作简便、对样品纯度要求适中，特别适合早期筛选阶段的大量样品快速评估。而SPR技术则在动力学参数测定和复杂样品分析方面具有独特优势。将多种生物物理技术进行策略性整合，可以从不同维度验证和深化对分子互作的理解。
例如，在靶点验证阶段，可先利用nanoDSF-TSA快速确认化合物与靶蛋白是否存在结合，再通过MST测定亲和力数量级，最后对精选化合物使用SPR进行精确的动力学表征。这种"由粗到精"的分层筛选策略，能够在保证数据质量的同时显著提高研发效率。国内已有机构建立了涵盖SPR、MST、nanoDSF、DSF-TSA及质谱分子互作平台的综合生物物理服务体系，为创新药研发提供了从靶点验证到候选化合物优化的全流程支持。
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