《食品科学》：四川郎酒集团有限责任公司沈毅正高级工程师等：芽孢杆菌混合种子液对高温大曲质量的影响

酒曲在酿造过程中起着至关重要的作用，对白酒的风味、产量和品质具有显著影响，尤其是酱香型白酒。它为白酒酿造提供了微生物、粗酶、风味物质及前体物质等必要成分。根据原料和制曲工艺的不同，曲可分为大曲、小曲和麸曲等类型。大曲是中国白酒生产的关键原料，兼具糖化、发酵和生香功能。根据最高品温或风味/香气特性，大曲可以分为低温型、中温型、高温型，以及酱香型、浓香型、清香型和兼香型。

最具代表性的当属用于酱香型白酒酿造所需的高温大曲，其发酵过程需在温度＞60 ℃（60～70 ℃）、相对湿度＞90%的条件下进行。这种独特的发酵环境造就了高温大曲独特的香气与风味，并有利于筛选出适合酿造酱香型白酒的有益微生物。高温大曲中的主要风味化合物包括四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、丙酸、1,3-丁二醇、愈创木酚、苯乙醇、苯甲酸甲酯和乙酸等。高温大曲的糖化、液化及发酵能力低于中、低温大曲。

高温大曲的质量是影响酱香型白酒品质的关键因素之一。在酱香型白酒的酿造过程中，作为重要的辅助原料，大曲与谷物的比例高达1:1。吡嗪类化合物是主要的香气/风味成分，其浓度超过3.0 g/L，高于其他类型的白酒。

酱香是高温大曲的独特特征，而吡嗪类化合物是形成酱香特征的主要成分。但是，酱香型大曲生产工艺面临三大挑战：1）高温大曲的酱香不够浓郁；2）随着酱香型白酒产量的增加，对高温大曲的需求相应上升；3）新建曲房生产的高温大曲质量参差不齐。因此，提升高温大曲品质并建立统一的评估标准，已成为酱香型白酒生产企业亟待解决的问题。当前，酱香型白酒酿造技术的进步主要集中在提升高温大曲的香气、优化大曲生产工艺，以及引入功能性微生物以生产更优质的高温大曲。

高温大曲中的香气与风味物质与发酵谷物混合后，既成为微生物生长和代谢的基础营养物质，也是合成相应酒体风味物质的前体物质。经过固态发酵和蒸馏后，这些物质最终进入成品白酒（或基酒）中。因此，高温大曲的质量直接影响发酵过程及成品白酒的品质，需要特别关注。从高温大曲中分离出两种高产吡嗪的功能菌株，并通过不同培养方法将其应用于高温大曲原料中。

四川轻化工大学食品与酿酒工程学院、酿酒科学与技术四川省重点实验室袁思棋、四川郎酒集团有限责任公司的何琪、沈毅*，四川轻化工大学食品与酿酒工程学院的刘君*等旨在探究微生物培养基对高温大曲的生物干扰作用，并评估不同培养方式对高温大曲感官指标、吡嗪含量及理化指标的影响。该研究成果为深入研究高温大曲、白酒风味物质以及提升江西兴白酒品质提供了理论依据。

1 不同发酵阶段高温大曲的稀释曲线与微生物多样性

本研究采用 Illumina MiSeq 平台（PE300，ASV分析流程）对实验组和对照组的高温大曲制曲过程的微生物群落进行测序分析，优化后共得到627 156 条有效原核微生物序列426 096 条有效真菌序列。各样本在不同测序深度时的 Shannon指数构建稀释曲线（图1），结果显示随着测序深度的增加，曲线趋于平稳，表明测序量充足，测序数据合理。

2 不同发酵时期高温大曲微生物群落结构α-多样性分析

通过评估α多样性指数，获得了样品中原核与真核微生物物种丰富度及多样性的信息（表1和表2）。高温大曲样本的微生物群落测序覆盖率为1.00，表明样本中的微生物群落已实现全序列覆盖。这说明物种丰度与多样性结果可靠，可用于后续分析。基于微生物数据库及测序数据分析得出的α多样性数据显示：高温大曲中原核微生物的物种丰度与多样性均高于真核微生物。

原核微生物的多样性（以Chao指数和Shannon指数衡量）在整个高温大曲发酵过程中持续波动（表1）。对微生物演替过程的观察结果与Sun Yangyang等的研究结果基本一致——将初始多样性波动归因于高温胁迫下耐热芽孢杆菌属的优势地位。其可能原因在于：温度和湿度的快速上升导致高温大曲发酵早期阶段大多数不耐热微生物死亡；与此同时，耐热微生物（如芽孢杆菌属和放线菌属）迅速增殖。随着发酵进程推进（Shannon指数），微生物逐渐适应不断变化的环境因素，并持续积累代谢产物，直至发酵进入中后期。

在整个发酵过程中，发酵大曲的Simpson指数显著高于储存大曲，表明发酵大曲中的微生物群落分布更为均匀。随着高温大曲生产的推进，原核微生物群落的分布趋于稳定。根据Chao指数，无论是第一次翻曲的大曲还是储存大曲，第2号强化大曲的微生物多样性均优于第1号强化大曲和对照组。相比之下，通过Simpson指数衡量的样本总体多样性在初期有所上升，随后逐渐下降。

在整个发酵过程中，第2号强化大曲的真核微生物多样性普遍优于第1号强化大曲和对照组（表2）。随着发酵进程的推进，反映真核微生物丰富度的指标（Sob指数和Chao指数）通常呈现先上升后下降的趋势，与Wu Cheng等的研究结果相似。这一现象可归因于高温大曲初始发酵阶段微生物剧烈的生化代谢活动：该过程消耗了发酵室内的大部分氧气，导致需氧真菌数量持续减少；随着发酵室温度和湿度的升高，高温大曲中的孢子开始萌发，从而促进了真核微生物多样性的提升。随着发酵进程的推进，强化大曲（实验组）与对照组中的真菌多样性分布（Simpson指数和Shannon指数）趋于更加均匀。

在相同的发酵周期内，与对照组相比，实验组的微生物丰富度（索布指数和赵氏指数）及微生物多样性（Simpson指数和Shannon指数）均未表现出显著差异。随着大曲高温发酵过程的进行，实验组与对照组的微生物丰富度和多样性变化趋势保持一致。

3 不同发酵时期高温大曲微生物物种组成分析

3.1 基于门水平的高温大曲微生物菌群结构分析

3.1.1原核微生物群落结构

从门水平层面考察了高温大曲ASVs的群落结构（图2）。在整个发酵过程中共检测到15个细菌门。其中四个优势门（相对丰度≥1%）被明确鉴定为：厚壁菌门（Firmicutes，54.82%）、放线菌门（Actinobacteriota，18.18%）、变形菌门（Proteobacteria，17.07%）和蓝藻菌门（Cyanobacteria，9.28%），该结果与Hou Qiangchuan等的研究结果一致。

在大曲发酵期间，变形菌门（Proteobacteria）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）在实验组和对照组中均表现出相对较高的丰度。随着发酵进程的推进，这两个微生物门类群落的丰度持续下降。值得注意的是，在培养期间的第一次翻曲工艺时，蓝藻菌门（Cyanobacteria）不再占据主导地位，可能源自谷物（如小麦）及大曲制作环境。

厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）在发酵大曲中的丰度较低，但它们在整个发酵过程中均为最丰富的菌门，在样本中的相对丰度超过90%（图2）。强化大曲中厚壁菌门（Firmicutes）对原核生物序列的贡献显著高于对照组。放线菌门（Actinobacteriota）对原核生物序列的贡献在强化大曲样本中与对照组相当，且低于对照组大曲样本。

在整个大曲发酵过程中，尤其是第一次和第二次翻曲工艺阶段，蒸馏间内保持高温高湿环境，这抑制了大多数微生物的生长，同时有利于耐受高温高湿条件的微生物存活。厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）的细菌对高温及以下制剂具有耐受性。在高温环境下，微生物群落快速繁殖，经历剧烈的生理生化反应并积累代谢产物，从而形成独特的微生物群落结构及高温大曲风味特征。其中，厚壁菌门是产生香气和酸度的关键微生物类群，也是高温大曲中的优势微生物类群。与对照组相比，实验组的厚壁菌门丰度更高，而放线菌门丰度更低；原核微生物群的优势菌种及其丰度波动模式保持稳定。

3.1.2真核生物群落结构

样品中鉴定出五个真核生物门（子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、未分类真菌门unclassified_k_Fungi、毛霉菌门Mucoromycota及其他Others），其中子囊菌门占比高达98.19%（图3）。在大曲发酵期及第一次翻曲阶段，还检测到担子菌门、未分类真菌门、毛霉菌门等其他门类的存在，但其丰度随发酵进程逐渐降低。与对照组相比，各实验组在优势微生物群落及其生长与衰退模式方面均未观察到显著差异。子囊菌门微生物类群是酒曲中最丰富的类群（占比超过90%），也是白酒发酵过程中产乙醇效率最高的微生物，使得白酒香气更为和谐且带有花香特征。从某种程度上说，这解释了高温大曲和酱香白酒花香特征的成因之一。

在原核生物方面，强化大曲与对照组的微生物结构存在显著差异，而真核生物结构未观察到显著差异。与对照组大曲样本相比，强化大曲样本中芽孢杆菌属Bacillus spp.（如解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens和蜡样芽孢杆菌B. cereus）引起的生物扰动似乎增加了厚壁菌门和子囊菌门的丰度。然而，在门水平上，这种扰动并未显著影响高温大曲中优势原核微生物群落及其生长与衰退模式。这归因于高温大曲储存后温度和湿度的快速上升——此类高温高湿条件有利于耐受这些环境的微生物（如厚壁菌门、放线菌门和子囊菌门）的生长繁殖。

初始发酵阶段，通常高达40℃至60℃的温度升高，加之大曲基质中淀粉和蛋白质分解导致的水分含量增加，共同为微生物活动创造了理想环境。厚壁菌门（Firmicutes）这一以嗜热物种著称的微生物门类，在这些条件下繁衍生息，促进了有机酸和酶的生成，进而推动发酵过程。放线菌门（Actinobacteriota）包含多种需氧和厌氧细菌，在将复杂有机化合物分解为更简单的代谢物过程中发挥着关键作用。子囊菌门（Ascomycota）作为多样化的真菌类群，得益于潮湿环境——其孢子易于萌发，菌丝能分解大曲中含有的纤维素和半纤维素。

这些微生物共同构成了一个复杂的微生物群落，不仅在高温高湿条件下存活下来，还蓬勃发展，显著影响了大曲的风味、香气及整体品质特征。此外，在经解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）强化的大曲中，相应的厚壁菌门、放线菌门和子囊菌门菌种比例相对较高；两种接种方法所获得的原核与真核微生物群落结构也未呈现显著差异。

3.2 属水平上的微生物群落结构

3.2.1原核微生物的相对丰度

原核微生物群落的属级分类基于获得的ASV物种分类信息进行分析。所有线粒体DNA和叶绿体DNA来源的ASV均未纳入本次分析。所有样本中共鉴定出278个丰度较高的细菌类菌属微生物。在强化大曲样本与对照组大曲样本中，相对丰度>1%的24个优势菌属包括：芽孢杆菌属Bacillus、糖多孢属Saccharopolyspora、短枝芽胞杆菌属Scopulibacillus、嗜热放线菌属Thermoactinomyces、norank_f_Pseudonoscardiaceae、Virgibacillus、葡萄球菌属Staphylococcus、乳酸杆菌属Lactobacillus、魏斯氏菌属Weissella、金微菌属Chryseomicrobium、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium、不动杆菌属Acinetobacter、Nesterenkonia、假单胞菌属Pseudomonas、糖单孢菌属Saccharomonospora、链霉菌属Streptomyces、平球菌属Planococcus、Exiguobacterium、Brachybacterium、乳球菌属Lactococcus、副球菌属Paracoccus、unclassified_f_Enterobacteriaceae、Glutamicibacter和unclassified_f_Planococcaceae等，以及其他未知和非主要属微生物类群归为“Other”（图4）。所有样本中均富含以下菌属：在初发酵大曲、二次发酵大曲及储存大曲样本中，芽孢杆菌属（Bacillus，14.37%）、糖多孢菌属（Scopulibacillus，7.87%）、短枝芽孢杆菌属（Scopulibacillus，7.94%）和嗜热放线菌属（Thermoactinomyces，5.38%）。

源自母曲和接种种子液的发酵大曲样品中芽孢杆菌的丰度相对较低（图4）。在发酵过程中，所有大曲样品中的芽孢杆菌丰度均呈现初始上升趋势，从而实现了强化大曲中芽孢杆菌丰度的提升目标。芽孢杆菌微生物促进了高温大曲中吡嗪类物质的生成；其代谢产物赋予高温大曲酱香、花香、果香及烘焙香气。然而，吡嗪类物质具有一定的抗菌特性，并可作为抗菌剂合成的前体物质——它们对大肠杆菌及其他细菌表现出显著抑制作用，这可能与发酵后期多种微生物属丰度的下降有关。

在整个发酵过程中，嗜热放线菌Thermoactinomyces的丰度先显著上升、随后下降，最终再次回升，这一现象在1号强化大曲样品中尤为明显。嗜热放线菌能够产生耐热酶，如α-淀粉酶、蛋白酶、脱氢酶和纤维素酶，可分解小麦中的大分子营养物质，为其他微生物的生长繁殖提供养分，从而有利于大曲中其他微生物的增殖。据王富荣等报道，嗜热放线菌会产生具有酱香特征的吡嗪类挥发性化合物，以及带有泥土味和不愉快气味的二甲基萘醇。这表明嗜热放线菌中的微生物能提高原料利用率，并产生特定的香气/风味物质以提升大曲品质。

在高温大曲中，糖多孢菌属常为优势菌属。在实验组和对照组中，随着发酵进程的推进，该菌属在高温大曲样本中的数量呈现先下降后上升的趋势。邓灿等发现芽孢杆菌属和糖多孢菌属是优质高温大曲中的主要菌属。由此推测出，芽孢杆菌属和糖多孢菌属对优质高温大曲的黄褐色外观、浓郁酱香和曲香具有重要贡献。在1号强化大曲和对照组大曲样本中，短枝芽孢杆菌属Scopulibacillus的丰度先增加后减少；而在2号强化大曲样本中，其丰度则先减少后增加，其变化模式与王晓丹等的报道一致。

与对照组相比，实验组的芽孢杆菌属菌群数量显著增加。芽孢杆菌的生长与衰减模式在整个发酵过程中保持稳定：初期数量增加，随后逐渐减少。第2号强化大曲的微生物多样性显著高于第1号强化大曲及对照组，差异具有统计学意义。由此表明，在高温大曲发酵过程中，添加芽孢杆菌种子液不仅能提高芽孢杆菌的丰度，还能显著影响大曲样本中其他微生物的生长；不过该处理并未改变微生物的水平演替模式。上述微生物结构变化的主要原因可能如下：1）曲室的温度、湿度及曲块温度均迅速上升；2）在第一次和第二次翻曲过程中，温度和湿度先快速下降，随后又显著回升；或3）耐高温的芽孢杆菌属、热放线菌属和糖多孢菌属等微生物迅速增殖并产生代谢产物。与此同时，某些代谢产物（包括酸类和吡嗪类化合物）抑制了微生物生长，最终形成了高温大曲独特的原核微生物结构。

3.2.2真核微生物的相对丰度

根据ASV在属水平上的分类信息，对实验组和对照组高温大曲样本中的真核微生物群落结构进行了分析。大曲样本中共鉴定出108 个属真菌类微生物，其中16 个属的相对丰度≥1%，包括嗜热丝孢菌属Thermomyces、嗜热曲霉属Thermoascus、未分类_曲霉科unclassified_f_Aspergillaceae、链格孢属Alternaria、伊萨氏菌属Issatchenkia、曲霉属Aspergillus、米勒酵母属Millerozyma、表皮霉属Epicoccum、镰刀菌属Fusarium、瓦勒米属Wallemia、枝孢属Cladosporium、毕索霉属Byssochlamys、未分类_真菌属unclassified_k_Fungi、假皮霉属Pseudopithomyces、红曲霉属Monascus和拉萨姆森菌属Rasamsonia。其余未知及非优势属被归类为“Other”（图5）。

所有样本中真菌微生物属水平上的优势微生物群落及其相对丰度如下：嗜热丝孢菌属（Thermomyces，28.77%）、嗜热霉菌属（Thermoascus，27.05%）、未分类_曲霉科（unclassified_f_Aspergillaceae，16.27%）、链格孢属（Alternaria，10.71%）、伊萨氏菌属（Issatchenkia，6.62%）、曲霉属（Aspergillus，2.64%）、米勒酵母属（Millerozyma，1.35%）以及表皮霉属（Epicoccum，1.22%）。在储存的大曲中，嗜热丝孢菌属Thermomyces、嗜热曲霉属Thermoascus占据绝对优势，与现有相关研究结果的发现基本一致。

在强化大曲样本中，嗜热丝孢菌属的丰度在第一次和第二次翻转过程中先下降，随后在储存期间迅速上升。嗜热丝孢菌属与糠醛、苯甲酸甲酯等挥发性物质呈显著相关性，且与苯甲酸甲酯的相关性尤为显著。强化大曲中的嗜热曲霉属丰度先升高后降低。嗜热曲霉属常见于含水量高、空气接触极少的大曲芯样品中，这些区域也栖息着大量微生物。该属与多种挥发性化合物（如2,6-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪）存在显著相关性。

曲霉属在发酵大曲及源自小麦和湿稻草的第一次翻曲的大曲样本中丰度较高（图5）。稻草在高温大曲发酵过程中的二次利用有利于此类微生物的生长。曲霉在代谢过程中会产生黄曲霉毒素，其含量与高温大曲的质量呈负相关。因此，上述微生物的生物量不应过多，因为它们的代谢产物会在固态发酵过程中进入糟醅发酵，并随之进入基酒中，最终影响白酒的质量。

链格孢属微生物在发酵大曲中含量丰富，但随着高温大曲发酵的进行，其丰度几乎消失。同样，在1号强化大曲样本中，伊萨氏菌属Isatchenkia微生物类群占比相对较高（接近90%），但在后续发酵过程中该类微生物几乎完全消失。在2号强化大曲样本中，未分类的曲霉科菌群绝对数量占比超过95%，与对照组及1号强化大曲存在显著差异，且其生物量在后续发酵过程中显著下降。类似地，该类微生物也被鉴定为浓香型中高温大曲一级样品中的优势菌属。

本研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）种子液的不同添加方式对高温大曲中优势真菌属的多样性变化具有显著影响。对上述现象可能存在以下解释：首先，采用不同添加方式（强化型大曲1号与2号）的解淀粉芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌种子液产生的生物扰动，影响了优势真菌群落结构在属水平上的组成；其次，耐热细菌（包括芽孢杆菌属、嗜热放线菌属、嗜热丝孢菌属、嗜热曲霉属等）产生了大量代谢产物，这些产物可能通过复杂反应生成有机酸、吡嗪类及其他抑制真菌生长的代谢物；最后，翻曲工艺导致发酵室内部温度和湿度发生剧烈变化，干扰了真菌的正常代谢活动。

4 不同发酵阶段的高温大曲差异微生物

各实验组与对照组大曲样本间的原核与真核微生物构成均存在显著差异。本研究采用平台软件的线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）来分析实验组与对照组之间的差异微生物群落（图6a）。LDA图展示了实验组与对照组间存在显著差异的微生物，柱状图长度反映了不同微生物物种的影响程度（图6b）。

物种层级树状图（图6a）与LDA判别柱状图（图6b）共同显示，所有实验组中共鉴定出21种具有显著差异的微生物（lg LDA＞3，P＜0.05）。根据实验组与对照组的数据，在不同发酵阶段均观察到差异微生物的显著变化（图6）。第一次翻曲阶段（Q1）的差异微生物包括：碱杆菌科Alcaliginaceae、乳酸杆菌科Lactobacillaceae、明串珠菌科Leuconostocaceae、类芽孢杆菌科 Paenibacilliaceae、葡萄球菌科Staphylococcaceae、嗜热放线菌科Thermoactinomycetaceae，以及博德特菌属Bordetella、乳酸杆菌属 Lactobacillus、明串珠菌属Leuconostoc、类芽孢杆菌属Planifolium、平叶菌属Paenibacilli和葡萄球菌属Staphylococcus。第二次翻曲阶段（Q2）的主要差异微生物为芽孢杆菌科Bacillaceae、诺卡氏菌科Nocardiaceae和克罗氏菌属Kroppenstedtia。储存大曲样品（Q3）的差异微生物包含皮肤杆菌科Dermabacteriaceae、假诺卡氏菌科Pseudonocardiaceae、短杆菌属Brachybacterium、糖多孢菌属Saccharopolyspora、嗜热放线菌属Thermoactinomyces及norank_f_Pseudonocardiaceae。在相应检测条件下，各发酵大曲样品中的原核微生物种类未发现显著差异。

乳酸菌属（Lactobacillus）主要为兼性厌氧或厌氧细菌，能够产生乳酸。乳酸可进一步转化为乳酸乙酯及其他芳香与风味成分的关键前体物质，这些成分对大曲的香气具有重要影响。经过发酵和蒸馏后，乳酸进入白酒基酒中，进而影响白酒的香气与口感。主要来源于小麦的葡萄球菌属和嗜热放线菌属与大多数非挥发性有机化合物呈负相关，其中嗜热放线菌属微生物具有强大的产果胶酶能力，能够呈现出吡嗪类化合物的大曲酱香特征，而二甲基萘醇则赋予其泥腥味。

根据真菌LEfSe层次树（图7a）和LDA判别柱（图7b），所有样本中共检测到19 个差异物种（lg LDA＞4，P＜0.05）。发酵大曲样本（Q）中鉴定出的主要微生物包括下霉目Hyporales、多孢霉目Pleosporales、乳霉科Nectriaceae、多孢霉科Pleosporaceae和链格孢属Alternaria。第一次翻曲阶段（Q1）大曲样本鉴定出的微生物则包含小孢子菌目Glomerellales、糖酵母目 Saccharomycetes、丝孢目Sordariales、曲霉科Aspergillaceae、毛霉科Chaetomiaceae、德拜霉目Debayomycetae、丛枝霉科Plectophaerellaceae、曲霉属Aspergillus、欧氏霉属Eurotium、米勒酵母属Millerozyma、Musicillium、毛霉属Myceliophthora和青霉属Penicillium。储存后的大曲样本（Q3）中的差异微生物属于欧氏菌目Eurotiales。在给定的提取条件下，各发酵大曲样品间的真核微生物物种未观察到差异。

与此同时，高温大曲在不同发酵阶段存在的独特微生物共同产生了独特的香气/风味物质。这些物质不仅是后续微生物生长繁殖的必需条件，也是其他代谢产物合成的前体。不同微生物的存在促使大量代谢产物生成，赋予大曲独特的香气/风味及感官特性，进而影响其外观和挥发性香气/风味化合物的组成。这些特定的微生物丰度决定了大曲的成熟度，并成为衡量大曲成熟度的重要指标。此外，在大曲不同发酵阶段进行微生物筛选与资源利用，促进了核心微生物群落的演替，从而提升了大曲品质、缩短了储存时间，并有效降低了生产时间和成本。

5 不同发酵阶段高温大曲中的吡嗪类化合物及感官分析

5.1 高温大曲中的吡嗪类化合物

为研究大曲发酵过程中的吡嗪类化合物，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合高效液相色谱-质谱联用（HS-SPME）进行检测，吡嗪类化合物的总含量详见表3和图8。发酵大曲中吡嗪类化合物的来源可能来自混入原料中的母曲。在第二次翻曲的大曲样品中，实验组II的总吡嗪含量（4 408.34 μg/g）显著高于实验组I（2 986.16 μg/g）和对照组（1 344.15 μg/g），表明共培养的芽孢杆菌菌株增强了吡嗪类化合物的合成（P＜0.05）。

同样，在储存的大曲中，强化组2号大曲的吡嗪类化合物含量高达3 376.89 μg/g，显著高于强化组1号大曲（2 842.47 μg/g）和对照组（1 868.78 μg/g）（表3）。上述提及的吡嗪类化合物中，实验组的主要成分包括2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪。从吡嗪类化合物总量的变化趋势来看，强化大曲样品在发酵过程中呈现先显著增加后略有下降（从第二次翻曲到储存大曲阶段），而对照组则观察到显著增加（表3，图8）。

储存大曲样本中2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪及2,3,5,6-四甲基吡嗪的浓度通常低于第二次翻曲阶段的大曲样本；而其他吡嗪类化合物的含量在整个发酵过程中保持稳定（呈上升趋势）。2号强化大曲（第一次和第二次翻曲工艺阶段）中2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪及2,3,5,6-四甲基吡嗪的浓度均显著高于1号强化大曲及对照组。其中，2号强化大曲在第二次翻曲工艺的大曲样品时2,3,5,6-四甲基吡嗪浓度达到峰值（2,345.45 μg/g）（表3）。1号强化大曲的储存样品中检出高浓度的2-甲基吡嗪（519.21 μg/g），而2号强化大曲的储存大曲样品中检测到高浓度的2,3,5-三甲基吡嗪（408.72 μg/g）。

2,3,5,6-四甲基吡嗪的香气与加热后的牛肉和猪肉脂肪以及发酵大豆的香气相似，其在大曲制作过程及糟醅堆积发酵过程中美拉德反应产生的；同时，该化合物具有多种药理作用，包括血管舒张、轻度降低血压以及改善组织微循环。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪具有酱油和烘焙的香气/风味，常见于糟醅、白酒和大曲中。2-甲基吡嗪带有巧克力和可可的香气/风味，是重要的化学原料及制药中间体，同时具有浓郁的烤花生或土豆香气，可用作食品添加剂。

与对照组相比，实验组（1号强化大曲和2号强化大曲）中的吡嗪类化合物总量更高；其中，2-甲基吡嗪、二甲基吡嗪、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的含量在实验组中显著升高（图8）。本研究中，添加芽孢杆菌种子液有效提高了高温大曲中芽孢杆菌的生物量，从而显著提升了吡嗪类化合物的浓度和总量。如酱香型白酒研究的相关报道，芽孢杆菌属可通过美拉德反应或氨基酸的微生物降解促进吡嗪类化合物生成。

5.2 高温大曲感官分析

高温大曲的质量评估主要依赖感官指标，包括色泽与香气、水分含量、酸度、糖化能力及淀粉含量等理化指标。为深入研究大曲的感官特性及其变化趋势，研究人员对不同发酵阶段的大曲块外部表面、横截面（或断裂面）以及香气/风味进行了感官评价。

对照组大曲块的外部表面呈黄褐色，部分大曲块呈现灰褐色和白灰色（＞3%；表4，图9）。同时，对照组大曲块具有明显的曲香和烘烤香气。与此同时，对照组中的大曲块呈现出明显的曲香和烘焙香气；曲房中层散发明显的曲香，伴有轻微霉味。实验组的灰白色与黑褐色大曲块数量较少，而黄褐色大曲砖的数量显著高于对照组（表4）。

与对照组相比，实验组（强化大曲样品）的外表面和香气均存在显著差异。实验组样品的外表面呈黄褐色（＞95%；表4）；位于曲房表层的大曲样品表面呈浅棕色（图9），横截面呈灰白色且菌丝明显可见（＜2%；表4，图10）。位于曲房顶部的2号强化大曲样品外表面呈浅棕色，其颜色显著深于对照组（表4，图9）。2号强化大曲样品的横截面可见明显的菌丝。与此同时，1号强化大曲样品的外表面和颜色均明显深于对照组（图9），其横截面菌丝也更为显著（图10）。

1号强化大曲散发出明显的酱香、豆豉香、曲香，并带有花香气息；2号强化大曲则呈现出浓郁的酱香、豆豉香与烘焙香，同时伴有甜美鲜明的曲香以及怡人的花果香气（表4）。

因此，在高温大曲的外观表面、横截面（或断裂面）及香气方面，强化大曲样品均显著优于对照组。特别是，2号强化大曲的香气比1号强化大曲及对照组更为突出。高温大曲的质量直接影响基酒品质。

5.3 高温大曲的理化特性

大曲为白酒酿造提供了最丰富的微生物资源。不同等级大曲感官特性的差异源于其制曲工艺参数的不同；不同等级大曲间微生物群落结构的差异会导致其理化性质、香气/风味及感官特性存在差异。

如表5所示，实验组与对照组的理化性质均存在差异。实验组与对照组的大曲样品含水量存在差异，所有储存的大曲样品均达到<13%的含水量标准（1号强化大曲除外）。储存大曲样本仍需继续存放一段时间，即称为成品大曲，将于白酒酿造中使用。含水量在大曲分级中具有重要作用。

酸度是制大曲过程中最重要的品质指标之一，也是判定大曲等级的关键标志，反映了大曲块中微生物的生长情况。实验组的酸度呈现显著上升趋势（从发酵大曲到第一次翻曲的大曲样本，酸度增加了2～3 倍，见表5），随后又显著下降（从第二次翻曲的大曲到储存大曲样本）。同样，第一次翻曲大曲和储存大曲的酸度均显著高于对照组，但实验组的酸度增幅超过两倍，而对照组则保持不变。适宜的酸度能够抑制杂菌生长，并为白酒酿造过程中的有益微生物提供理想的生长环境。

大曲中的淀粉含量反映了微生物在曲房内发酵过程中消耗的淀粉量。在大曲发酵过程中，淀粉消耗率越高，微生物繁殖和代谢活动就越活跃，意味着大曲中的代谢产物含量也越高，从而为后续窖内发酵提供更多的前体物质及香气/风味成分。然而，在第一次翻曲和储存大曲样本中，2号强化大曲的淀粉消耗量低于第1号大曲和对照组（表5）。总体而言，2号强化大曲的总淀粉消耗率高于1号强化大曲及对照组，表明2号强化大曲中的微生物分解淀粉的能力强于1号强化大曲及对照组。进一步证明，添加芽孢杆菌种子液与混合培养物有助于大曲微生物有效分解淀粉，从而证实混合培养物的添加能提升大曲品质。淀粉消耗率的变化与大曲相应的糖化活性存在一定差异（表5）。具体而言，除储存大曲样品外，2号大曲样品在其他发酵阶段的糖化活性均高于1号大曲样品。这些结果反映了大曲中微生物或酶水解淀粉并生成糖的能力。上述数据也能解释对照组横截面上“火圈”结构的缺失、灰白色粗糙表面及颜色不均的现象（图9、10），这些特征符合将其判定为低等级大曲的标准。

大曲中的微生物繁殖和代谢会产生大量酶类，如淀粉酶和蛋白酶。蛋白酶在大曲发酵过程中起着关键作用，能够降解蛋白质、生成芳香物质前体，并促进微生物生长与代谢（蛋白酶活性呈现上升趋势，见表5）。蛋白酶活性在不同阶段存在差异，且受温度、湿度及水分等因素影响。

上述结果表明，向高温大曲中添加解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和蜡样芽孢杆菌（B. cereus）种子液可显著增强微生物生物量，从而影响优势微生物群落结构。同时，种子液的添加改善了大曲样品的理化指标，提升了高温大曲品质：黄色棕色大曲块数量增加，而灰白色与黑色棕色大曲块减少。类似地，芽孢杆菌种子液的添加有利于大曲中有机酸、糖类、氨基酸及其他风味物质的生成与积累；这些物质经微生物代谢后随大曲与糟醅混合进入堆积发酵和窖池发酵。因此，大曲微生物生长代谢产生的各类酸性物质导致酸度升高；酸度升高又促进酯类物质生成，从而改善大曲香气/风味品质，并为窖内发酵提供风味前体物质。窖池发酵完成后，糟醅中的风味物质通过蒸馏进入基酒。在一定程度上，添加芽孢杆菌种子液可能显著影响大曲发酵过程，例如大幅改善大曲的外表面特性及其物理化学指标（如酸度和糖化活性）。

结 论

本研究全面比较了实验组与对照组的高温大曲样本在微生物群落结构、理化特性及吡嗪化合物方面的差异。强化大曲的微生物群落结构、感官评价及吡嗪物质含量均符合传统高温大区（对照组）的分类标准，且其感官评价在一定程度上与理化特性相关。此外，微生物多样性、感官评价及理化指标均表明，强化大曲的品质优于对照组。

添加芽孢杆菌种子液未影响原核与真核微生物在门和属水平上的群落结构；然而，该添加显著提高了实验组中芽孢杆菌属的生物量。实验组与对照组在属水平上的原核微生物丰度变化趋势一致。与此同时，添加芽孢杆菌种子液增加了吡嗪类化合物的总量，并提升了实验组中黄褐色大曲样品的数量与比例。

本研究中的强化大曲样品在微生物多样性、吡嗪化合物含量、理化特性及感官评价方面均显著优于传统大曲（对照组）。因此，在白酒酿造过程中后续应用强化大曲不仅能促进优质酱香型白酒的生产，也为提升高温大曲品质提供了理论与实践参考。本研究主要关注短期发酵效果，而长期储存对大曲微生物稳定性及吡嗪化合物总量的影响仍需进一步研究。

作者简介

通信作者：

刘君 教授

四川轻化工大学继续教育学院 院长

刘君，男，1978年5月生，博士研究生，教授，硕士生导师。毕业于德国汉堡大学（University of Hamburg）/西北工业大学。2014年5月入职四川轻化工大学任专职教师，四川大学—五粮液集团联合培养博士后。目前，担任《Fermentation》《Foods》《Frontiers in Microbiology》《Molecules》等期刊特邀编辑/审稿人。主要从事发酵微生物代谢产物代谢机理、微生物发酵相关蛋白质（酶）结构与功能的教学科研工作。近年来，发表较高影响力的科研论文20余篇，主持和参与科研项目13 项。

通信作者：

沈毅 正高级工程师

四川郎酒股份有限公司 副总经理、常务副总工程师

四川省古蔺郎酒厂有限公司 常务副总经理

郎酒品质研究院 院长

沈毅，男，1980年1月生，研究生，正高级工程师，硕士研究生导师。毕业于四川大学。在郎酒从事白酒酿造生产、酒体设计、勾调品评、质量管理、科研创新等技术工作二十年。发表论文30余篇，获得专利11 项，主持20余项省部级科研课题，获科技进步奖8 项，其中《红花郎酒生产工艺研究及应用》项目获四川省科技进步一等奖。发明专利“浓酱兼香型白酒的生产方法”项目获中国专利优秀奖、四川省专利特等奖；参与《酱香型白酒》《浓酱兼香型白酒》《白酒风味物质阈值测定指南》等五项国家标准的制定。荣获全国劳动模范、全国五一劳动奖章、全国技术能手、国家非物质文化遗产项目代表性传承人、四川省学术和技术带头人、四川工匠等荣誉称号；享受国务院政府特殊津贴。

第一作者：

袁思棋 副教授

四川轻化工大学食品与酿酒工程学院

袁思棋，男，1984年10月生，博士，副教授，硕士生导师。国家特邀白酒评委、国家露酒评委、国家一级品酒师，国家级职业技能考评员。毕业于中国科学院大学/中国科学院成都生物研究所。江南大学-泸州老窖集团有限责任公司联合培养博士后。目前，主持省级重点研发项目2 项，参与国家自然基金、省部级项目10余项。主要从事酒类风味化学、发酵微生物及其资源开发以及风味代谢途径等。基于发酵微生物及其代谢途径，检测和分析其代谢产物及其产生途径；以酒类为主要研究对象，分析酒类的物理化学性质。以第一作者或通信作者在《Current Research in Food Science》《 Droplet》《Fermentation》《Foods》《Frontiers in Microbiology》《Molecules》等杂志上发表30余篇论文。

引文格式：

YUAN Siqi, HE Qi, ZHAO Jinsong, et al. Effect of mixed inoculation of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus on the quality of high-temperature Daqu[J]. 食品科学, 2026, 47(7): 143-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250820-151.

YUAN Siqi, HE Qi, ZHAO Jinsong, et al. Effect of mixed inoculation of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus on the quality of high-temperature Daqu[J]. Food Science, 2026, 47(7): 143-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250820-151.

实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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