Adv Funct Mater (IF=19.9)｜抗体治疗迈向实时监测：CP1.1双传感平台同步检测阿达木单抗与抗药抗体！(陈啸飞/樊芳/张凤/刘耀阳/李全团队)

2026年7月6日，海军军医大学药学系陈啸飞/樊芳教授团队联合第二附属医院张凤教授、第三附属医院刘耀阳教授团队，在Advanced Functional Materials (中科院1区，TOP期刊，IF=19.9）发表题为“Paratope-Specific Recognition Biosensing Materials for Real-Time Monoclonal Antibody Detection and Personalized Therapy”的研究论文。该文于2025年11月30日投稿，2026年5月30日修回，2026年6月22日接收。

海军军医大学药学系陈啸飞、樊芳，第二附属医院张凤，第三附属医院刘耀阳为论文的共同通讯作者；研究生陈雨、张雨欣，第二附属医院/同济大学医学院附属淞南镇社区卫生服务中心庞涛为论文的共同第一作者。该研究开展过程中得到大学“深蓝人才工程”特聘导师东南大学李全教授，药学系柴逸峰教授，第二附属医院陈万生教授的关键指导。

单克隆抗体药物已广泛用于肿瘤、自身免疫病和感染性疾病治疗，但临床疗效常受到抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）产生的影响。如何快速、准确、动态监测患者体内单抗药物浓度和ADA水平，是实现个体化给药和精准治疗的重要前提。

该研究以阿达木单抗（adalimumab，ADL）为模型药物，提出一种双重生物传感策略：一方面，研究建立基于F(ab′)2片段的双向正/负噬菌体展示筛选方法，成功筛选出可识别ADL抗原结合位点的环肽CP1；另一方面，研究利用ADL来源单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）作为ADA识别单元。随后，团队将优化后的CP1.1和c-scFv分别修饰到金纳米颗粒（AuNPs）表面，构建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs传感材料，实现ADL和ADA的快速定量检测。

结果显示，该体系可在约2分钟内完成检测，与传统ELISA结果高度一致，并已应用于33例强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）患者的ADL和ADA动态监测。研究提示，该类“抗原结合位点特异性识别”生物传感材料有望为单抗药物治疗中的治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）、免疫原性评估和个体化用药调整提供新工具。

▶获取原文PDF文件，请关注本公众号，并在后台私信留言“20260716-3”，可自助获取！！！

☛或请关注本公众号“代谢与整合生物学”，然后点击下方链接，自动跳转下载页面：

代谢与整合生物学微信公众号_20260716-3.pdf

【摘 要】

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）治疗药物已成为肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的重要治疗手段。然而，抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）的形成常会削弱其疗效。准确、动态检测mAb药物和ADA，对于早期免疫原性评估和个体化给药具有重要意义。

本研究以阿达木单抗（adalimumab，ADL）为模型，开发了一种双重生物传感策略，可同时定量检测mAb药物和ADA。为解决mAb检测中缺乏抗原结合位点特异性识别元件的问题，研究建立了基于F(ab′)2片段的双向正/负噬菌体展示筛选方法，用于去除同源IgG干扰。通过该方法，研究成功鉴定出一种ADL抗原结合位点特异性识别肽CP1，其与ADL具有较高亲和力，解离常数KD为7.84 µM。

对于ADA识别，研究采用ADL来源的单链可变片段（single-chain variable fragment，c-scFv）作为靶向ADA抗原结合位点的识别单元。随后，研究将CP1和c-scFv分别偶联至金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs），构建用于ADL和ADA检测的生物传感材料CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs。该体系可在2分钟内实现快速定量，其检测结果与ELISA结果高度相关，相关系数R²=0.99。

这些经抗原结合位点特异性识别元件功能化的生物传感器，已成功用于33例强直性脊柱炎患者体内ADL和ADA的实时检测。该策略可支持个体化治疗方案优化，并为mAb治疗的精准管理提供一种实用方法。

01

研究背景及科学问题

单克隆抗体（mAb）治疗药物因具有高度特异性和良好临床疗效，已被广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病的靶向治疗。2024年，全球销量排名前十的药物中，mAb药物占据半数，远超小分子药物，其临床应用仍在逐年增长。然而，随着mAb药物临床应用不断增加，一些关键问题逐渐显现，包括治疗过程中难以快速、准确监测药物暴露水平，以及抗药抗体（ADA）产生等。

当外源性mAb被机体识别为外来抗原时，免疫系统会启动反应并产生ADA。中和性ADA可直接结合治疗性抗体，阻断其与靶点相互作用，从而消除药物活性。非中和性ADA虽然不直接干扰药物功能，但可与药物形成免疫复合物并加速清除，导致血清药物浓度持续偏低，无法维持治疗水平。因此，动态监测mAb浓度和ADA水平具有重要临床价值，可用于早期预警、准确诊断和及时干预。

然而，mAb、ADA与内源性IgG在结构上高度相似，仅在抗原结合位点结构域中存在少数氨基酸差异，因此同时准确检测mAb和ADA非常困难。造成这一困境的主要原因在于：绝大多数mAb药物缺乏特异性识别元件，同时也缺少实时动态检测方法。

肽类分子因分子量低、稳定性好、结构可调，被认为是mAb理想识别元件。与抗体或适配体相比，肽探针在传感界面上可实现更高表面密度和更均一固定，从而获得稳定一致的识别性能。目前，开发mAb靶向肽的策略主要包括计算机辅助设计和噬菌体展示筛选。前者依赖已知抗原结合位点结构，预测结果与实验验证之间往往一致性有限；后者在筛选过程中常受到非特异性IgG结合干扰。由于抗体Fc区域高度同源，如何消除IgG干扰并筛选出真正抗原结合位点特异性肽，仍是重要挑战。

为解决这一问题，本研究开发了基于F(ab′)2片段的双向正/负噬菌体展示筛选策略。该方法使用酶切获得的F(ab′)2片段作为靶分子，从而使噬菌体优先结合抗体可变区。同时，该策略在三轮筛选中结合针对IgG的负筛选和针对F(ab′)2片段的正向富集，可有效去除IgG交叉反应肽，并保留高抗原结合位点特异性结合序列。由于不同患者产生的ADA具有差异，通用肽探针并不适用于ADA检测，因此研究采用单链可变片段（scFv）作为识别单元。该片段可保留抗体特异性和结合能力，同时在不同pH和温度条件下具有更好的稳定性。

阿达木单抗（ADL）是临床最常用的mAb药物之一，因此本研究选择其作为模型，用于开发药物和ADA水平动态监测策略。目前，临床上ADL和ADA检测方法尚未标准化。虽然已有多种基于ELISA的方法，但其依赖TNF-α蛋白和ADL作为识别元件，存在成本高、稳定性差、制备复杂等限制。

本研究将筛选获得的ADL靶向环肽CP1（ACNPAHNNYCGGGS）和ADL来源单链可变片段c-scFv偶联至AuNPs，分别形成用于ADL检测的CP1.1@AuNPs和用于ADA检测的c-scFv@AuNPs。该系统检测结果与ELISA结果的一致性达到0.99，并可用于强直性脊柱炎患者ADL和ADA水平的实时监测，为抗体药物精准给药提供了新的方法。

02

重要发现及亮点

建立基于F(ab′)2片段的双向正/负噬菌体展示筛选策略

噬菌体展示技术可通过反复筛选富集高亲和力肽结合物，但在识别mAb特异性肽时，会受到大量内源性IgG的强烈干扰。mAb保守结构，尤其是Fc区域，会限制其抗原结合位点特异性；同时，生物样本中IgG水平远高于药物抗体，因此所需肽探针必须具备极高特异性和亲和力。

为克服这些限制，研究设计了基于F(ab′)2片段的正/负筛选策略。该方法去除Fc区域，以减少非特异性IgG结合，同时富集识别ADL特异性互补决定区（complementarity-determining regions，CDRs）的克隆。通过先去除IgG结合噬菌体，再筛选固定化ADL-F(ab′)2，该连续筛选流程可有效排除交叉反应克隆，并富集对ADL具有高特异性的肽序列。

图1：ADL抗原结合位点特异性识别肽筛选流程，以及将其功能化至AuNPs用于ADL和ADA精准检测的总体示意图。（a）采用基于F(ab′)2的正/负噬菌体展示筛选策略，筛选ADL特异性环肽。（b）利用功能化AuNPs建立ADL和ADA定量分析方法；功能化元件包括环肽以及ADL的scFv片段，图由BioRender绘制。（c）所开发的ADL和ADA同步检测方法可用于AS患者实时监测，图由BioRender绘制。通过整合参数分析和强直性脊柱炎疾病活动评分（Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score，ASDAS）评估，该方法为临床精准用药提供了一条新路径。

筛选获得ADL抗原结合位点特异性识别肽CP1

研究采用IgG正/负双相噬菌体展示策略，以ADL-F(ab′)2片段为靶标，对环状七肽噬菌体文库进行筛选。在三轮筛选中，每轮均预先去除对IgG具有亲和力的噬菌体，以提高靶向特异性。

结果显示，在各轮输入噬菌体滴度基本一致的情况下，回收率逐步升高：第一轮为1.13×10−6，第三轮升至1.61×10−4。回收率持续升高说明具有目标特异性亲和力的噬菌体被成功扩增和富集，也证明洗脱和筛选步骤有效。

在第三轮筛选后，研究进一步采用包被ADL-F(ab′)2或IgG的微孔板进行噬菌体滴定实验。ADL-F(ab′)2包被板中，即使稀释至104倍，噬菌斑仍多到难以计数，直到106倍稀释才出现可见蓝色噬菌斑；相反，IgG结合噬菌体在102倍稀释后仅有43个噬菌斑，103倍稀释后仅有4个噬菌斑。该结果进一步说明富集噬菌体对ADL-F(ab′)2具有特异性，而与IgG交叉反应较弱。

随后，研究从第三轮滴定板中随机挑选30个阳性单克隆噬菌体进行Sanger测序。共鉴定出6种不同肽序列，并按出现频率命名为CP1至CP6。其中CP1出现15次，占所有序列的50.00%，为最富集序列；CP2和CP3各出现4次，占13.33%；CP4出现3次，占10.00%；CP5和CP6各出现2次，占6.67%。

图2：F(ab′)2片段双向正/负噬菌体展示筛选结果。（a）各轮筛选中噬菌体输入量和回收率比较。（b）洗脱噬菌体克隆得到的肽序列。（c）第三轮洗脱液与阳性抗体ADL-F(ab′)2及阴性抗体IgG之间的蓝色噬菌斑计数比较。（d）最终一轮筛选所得噬菌体的测序结果。

CP1表现出对ADL的较高亲和力和特异性

获得阳性克隆序列后，研究首先采用噬菌体ELISA初步评估CP1—CP6的特异性。结果显示，展示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6的噬菌体与ADL-F(ab′)2结合时的响应值显著高于IgG对照，而CP3的差异不明显。这提示CP1、CP2、CP4、CP5和CP6对ADL-F(ab′)2具有一定特异性，但仍需进一步验证亲和力。

随后，研究采用表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）技术评价合成肽的特异性和亲和力。所有6种环肽均通过固相合成制备，纯度均超过95%，并经高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）确认。研究分别将ADL和IgG固定于CM5传感芯片，再注入不同浓度肽以检测结合相互作用。

SPR结果显示，CP1与ADL具有较高亲和力和显著特异性，解离常数KD为7.84 µM，并且与IgG无可检测结合。相比之下，CP2、CP3和CP4不同程度地同时结合ADL和IgG，说明特异性有限；CP5和CP6对ADL或IgG均未显示可测量结合。综合噬菌体ELISA和SPR结果，CP1被确定为最有潜力的候选肽，用于后续开发。

研究进一步利用分子对接和分子动力学模拟解析CP1与ADL-F(ab′)2之间的相互作用。AutoDock Tools 1.5.6对接结果显示，CP1与ADL-F(ab′)2具有较强结合亲和力，结合能为−7.99 kcal·mol−1。通常结合能低于−7.00 kcal·mol−1提示相互作用较强，负值则说明结合可自发发生，支持二者形成稳定复合物。结构模型显示，CP1与ADL-F(ab′)2之间的相互作用主要由氢键网络稳定。

残基水平结合能分析表明，ADL-F(ab′)2中的Thr-173、Phe-174和Tyr-95对结合贡献最大，结合能分别为−1.90、−1.80和−1.40 kcal·mol−1，提示这些残基在维持复合物稳定性中发挥关键作用。此外，Glu-156、Val-160和Glu-165等残基也参与相互作用，但贡献相对较小。这些关键残基位于配体结合口袋附近，可共同构建协同相互作用网络。

分子动力学模拟进一步显示，ADL-F(ab′)2–CP1复合物的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）在0.2—0.4 nm之间波动，相较游离ADL-F(ab′)2仅略有降低，提示整体结构稳定。均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）分析显示，两种体系具有相似波动模式，整体数值约为1 nm，在Thr-173附近存在轻微差异，与分子对接结果一致。回转半径（radius of gyration，Rg）在模拟过程中稳定在约2.4 nm，说明CP1结合不会引起明显构象改变。氢键分析显示，CP1与ADL-F(ab′)2之间可持续维持4—7个氢键，最多可达11个，提示存在稳定分子间相互作用。溶剂可及表面积（solvent-accessible surface area，SASA）分析显示，两者曲线几乎重叠，稳定波动于约200 nm²，进一步说明CP1结合未显著改变ADL-F(ab′)2整体结构。自由能景观分析显示，ADL-F(ab′)2以及ADL-F(ab′)2–CP1复合物均形成明确最低能量簇，复合物虽能量分布略宽，但仍处于稳定低能状态。MM/GBSA计算得到平均结合自由能为−31.88 kcal·mol−1，进一步证明CP1与ADL-F(ab′)2之间存在较强且有利的结合。

图3：环肽与ADL结合的验证。（a）噬菌体ELISA实验原理与流程图，由BioRender绘制。（b）环肽CP1—CP6对ADL和IgG对照的噬菌体ELISA响应。数据以均值±标准差（S.D.）表示（n=3）。（c）SPR分析CP1与ADL及IgG的结合亲和力。（d）ADL-F(ab′)2与CP1相互作用的分子模拟。（e）ADL蛋白中参与CP1结合的氨基酸残基能量贡献。（f–j）分子动力学（molecular dynamics，MD）分析：（f）RMSD，（g）RMSF，（h）Rg，（i）界面氢键，以及（j）SASA。（k）ADL-F(ab′)2上方部分和ADL-F(ab′)2–CP1下方部分的自由能分布图。

构建用于ADL和ADA特异性识别的AuNPs生物传感平台

鉴于CP1具有较高亲和力和特异性，研究进一步将其修饰到AuNPs表面，用于构建ADL检测传感器。首先，为提高CP1水溶性并便于其与AuNPs偶联，研究将CP1 C端GGGS序列替换为KKKC，得到水溶性更好的CP1.1（ACNPAHNNYCKKKC）。CP1.1经LC-MS和HPLC表征确认。SPR结果显示，CP1.1与ADL仍具有良好结合亲和力，KD为3.76 µM，低于CP1，且与IgG无非特异性结合。这说明CP1.1是一种可特异性结合ADL且水溶性良好的肽探针。

随后，研究通过Au–S键将CP1.1偶联到AuNPs表面，构建CP1.1@AuNPs生物传感器。由于CP1.1分子尺寸较小、表面堆积密度较高，肽功能化仅在相邻纳米颗粒之间产生较小空间位阻。UV–vis光谱显示，偶联后表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）吸收带无明显变化，说明单纯肽接枝不会导致显著等离子体耦合。透射电镜（transmission electron microscope，TEM）进一步显示，表面修饰后虽发生轻微颗粒间关联，但AuNPs仍基本保持球形形貌和较窄粒径分布。这提示短肽配体主要发挥表面稳定作用，仅引起有限纳米颗粒聚集。

与此同时，研究将c-scFv作为较大的生物识别元件用于捕获ADA，并通过Au–S键偶联至AuNPs，得到c-scFv@AuNPs生物传感器。与CP1.1相比，c-scFv分子尺寸更大、表面堆积密度更低，因此在纳米颗粒界面引入更明显空间效应。AuNPs的UV–vis光谱显示，c-scFv偶联后SPR峰轻微红移，提示局部介电环境发生一定变化，但此阶段尚未出现强等离子体耦合。TEM图像显示，其形貌总体与CP1.1@AuNPs相似，表现为轻度聚集，同时整体粒径均一性仍得以保留。

为评价CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分别对ADL和ADA的响应能力，研究系统检测其光学性质。当向56 µg/mL CP1.1@AuNPs中加入200 µg/mL ADL后，526 nm处SPR吸收峰明显下降，同时溶液颜色由粉红色转为浅蓝紫色，说明CP1.1@AuNPs可有效识别ADL。TEM图像证实，加入ADL后CP1.1@AuNPs出现靶标诱导聚集。动态光散射（dynamic light scattering，DLS）进一步显示，水合粒径由约32.70 nm增加至约50.70 nm，提示发生由肽介导的颗粒间交联引起的中等程度聚集。

类似地，向0.5 ng/mL c-scFv@AuNPs中加入200 µg/mL ADA后，526 nm吸收峰明显降低，并伴随颜色变化，证实c-scFv@AuNPs对ADA具有特异性响应。TEM结果显示，加入ADA后形成广泛互联的聚集网络。DLS检测显示，粒径由约58.80 nm急剧增加至约712.00 nm，提示形成大规模颗粒间组装，并产生更强等离子体耦合效应。

值得注意的是，c-scFv@AuNPs诱导的聚集较CP1.1@AuNPs更明显。这一差异可能与scFv分子量较大有关。scFv约25—30 kDa，而CP1.1约1—2 kDa。较大的分子尺寸导致scFv表面接枝密度较低，但提供更长有效结合距离和更大构象灵活性，从而有利于ADA识别时桥接相邻AuNPs，形成更大聚集体并增强等离子体耦合。相比之下，紧凑肽层虽可实现高表面覆盖，但主要通过短程相互作用介导聚集，因此形成的组装体相对较小，光谱位移也较弱。

图4：用于ADL和ADA检测的功能化AuNPs生物传感器构建。（a）CP1.1与ADL之间、CP1.1与IgG之间结合亲和力的SPR分析。（b）通过CP1.1和c-scFv与AuNPs偶联构建CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs传感器的示意图，由BioRender绘制，并分别用于ADL和ADA检测。（c）AuNPs、CP1.1@AuNPs和CP1.1@AuNPs@ADL的TEM图像。（d）CP1.1@AuNPs@ADL的动态光散射图谱。（e）AuNPs、c-scFv@AuNPs和c-scFv@AuNPs@ADA的TEM图像。（f）c-scFv@AuNPs@ADA的动态光散射图谱。（g）AuNPs、CP1.1@AuNPs以及与200 µg/mL ADL孵育后的CP1.1@AuNPs的UV–vis光谱。（h）AuNPs、c-scFv@AuNPs以及与90 AU/mL ADA孵育后的c-scFv@AuNPs的UV–vis光谱。（i）CP1.1@AuNPs（10 µg/mL）对多种mAb的UV–vis响应。数据以均值±S.D.表示（n=3）。（j）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）对多种mAb的UV–vis响应。数据以均值±S.D.表示（n=3）。（k）CP1.1@AuNPs（56 µg/mL）与不同浓度ADL（0、0.5、1、2、5、10、15、20和30 µg/mL）孵育后的UV–vis光谱。插图显示CP1.1@AuNPs（56 µg/mL）对不同浓度ADL的检测溶液颜色变化，以及0.5—30 µg/mL范围内A526 nm与ADL浓度的关系图。数据以均值±S.D.表示（n=3）。（l）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）与不同浓度ADA（1、10、25、50、70和90 AU/mL）孵育后的UV–vis光谱。插图显示c-scFv@AuNPs对不同ADA浓度的检测溶液颜色变化，以及1—90 AU/mL范围内A542 nm与ADA浓度的关系图。

CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs具有良好选择性并可实现实时定量检测

考虑到生物体系十分复杂，研究进一步评估CP1.1@AuNPs对ADL以及c-scFv@AuNPs对ADA的特异性。研究选择12种临床常用mAb以及IgG、IgA、IgE和IgM作为潜在干扰物，包括3种抗PD-1 mAb，即帕博利珠单抗（pembrolizumab，PEM）、替雷利珠单抗（tislelizumab，TIS）、纳武利尤单抗（nivolumab，NIV）；2种TNF-α抑制剂，即ADL、英夫利昔单抗（infliximab，IFX）；3种EGFR抑制剂，即贝伐珠单抗（bevacizumab，BEV）、西妥昔单抗（cetuximab，CET）、尼妥珠单抗（nimotuzumab，NIM）；以及1种HER2抑制剂维迪西妥单抗（disitamab，DIS）。每种mAb以100 µg/mL加入CP1.1@AuNPs或c-scFv@AuNPs溶液，并监测吸光度变化。

结果显示，CP1.1@AuNPs仅对ADL产生响应，其他mAb未引起明显UV吸收变化，说明CP1.1@AuNPs可特异性响应ADL。同样，c-scFv@AuNPs仅在ADA存在时吸光度发生明显改变，证实其对ADA具有特异性。重要的是，仅含ADL或ADA的溶液出现明显颜色变化，分别由粉红色转为淡紫色、由红色转为紫色。这进一步证明CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs分别对ADL和ADA具有较高特异性。

为进一步考察其检测能力，研究开展UV滴定实验。对于CP1.1@AuNPs，随着ADL浓度从0升高至30 µg/mL，526 nm处吸收峰逐渐降低。在该浓度范围内，A526 nm与ADL浓度呈良好线性关系，检测限（limit of detection，LOD）估计为0.45 µg/mL。同时，检测溶液颜色随ADL浓度升高由粉红色逐渐转为淡紫色，最终趋于透明，便于肉眼观察ADL水平。值得注意的是，所有测量均可在混合后1分钟内完成，提示CP1.1@AuNPs对ADL具有快速响应能力。

对于c-scFv@AuNPs，随着ADA浓度升高，542 nm处吸光度逐渐降低并略有蓝移。在1—90 AU/mL范围内，A542 nm与ADA浓度呈良好线性关系，线性方程为Y=−0.003766X+0.6715（R²=0.9831），LOD估计为0.89 AU/mL。溶液颜色也随ADA浓度增加由红色变为紫色。这些结果表明，c-scFv@AuNPs可根据ADA浓度产生UV吸收变化，适合用于ADA高灵敏定量分析。

基于二者对ADL和ADA的良好响应性能，研究进一步评估其在临床血清样本中的检测能力。考虑到血清背景噪声和基质效应可能造成干扰，研究建立了改良检测流程，用于准确量化血清中的ADL和ADA。为模拟临床条件，研究向正常血清中加入不同浓度ADL，并与CP1.1@AuNPs孵育后检测吸光度。结果显示，当血清中ADL浓度从0升至30 µg/mL时，526 nm处吸收峰按比例降低，ADL浓度与吸光度之间具有强线性相关，线性方程为Y=−0.003729X+0.5200（R²=0.9951）。这证实CP1.1@AuNPs可在人体血清中准确定量ADL，动态范围适合临床检测。

对于ADA定量，血清中ADA浓度在1—90 AU/mL范围内升高时，530 nm处UV吸收峰逐渐下降，并表现出良好线性关系。线性方程为Y=−0.001319X+0.4122（R²=0.9925），说明c-scFv@AuNPs可有效用于血清中ADA定量检测。

随后，研究将CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs用于接受ADL治疗患者的血清样本检测。结果显示，纳米颗粒检测方法与传统ELISA结果高度相关，ADL和ADA检测的相关系数分别为0.9921和0.9936。与其他已报道ADL检测方法相比，该方法具有更好的临床相关性、更低检测限、更快响应速度和更简便操作。上述结果说明，CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs可可靠检测临床血清样本中的ADL和ADA，为床旁检测（point-of-care，POC）分析提供实用准确工具，也可用于评估ADL和ADA血药水平，支持个体化精准治疗干预。

图5：使用功能化AuNPs进行血清样本分析。（a）所开发的基于功能化AuNPs的ADL和ADA检测流程与传统ELISA方法之间的示意性比较，由BioRender绘制。（b）CP1.1@AuNPs（56 µg/mL）与血清中不同浓度ADL孵育后的UV–vis光谱。（c）0.5—30 µg/mL范围内A526 nm与ADL浓度的校准曲线。（d）采用Passing–Bablok回归分析比较本研究UV–vis检测法与商业试剂盒在ADL定量中的方法准确性；p表示统计学显著性。（e）c-scFv@AuNPs（0.5 ng/mL）与血清中不同浓度ADA孵育后的UV–vis光谱。（f）1—90 AU/mL范围内A530 nm与ADA浓度的校准曲线。（g）采用Passing–Bablok回归分析比较本研究UV–vis检测法与商业试剂盒在ADA定量中的方法准确性；p表示统计学显著性。

ADL和ADA动态监测可辅助AS患者个体化治疗优化

强直性脊柱炎（AS）是一种慢性自身免疫性疾病，通常需要长期抗炎治疗，ADL是最常用的一线生物制剂之一。ASDAS常用于临床评估疾病活动度和治疗效果。根据ASDAS-C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）评分标准，评分≥2.1提示高疾病活动度，1.3≤评分<2.1提示低疾病活动度，评分<1.3提示疾病不活动。

然而，临床实践中可见部分患者即使ASDAS评分提示低活动度或不活动，仍持续存在疼痛、疲乏等症状。研究团队既往研究也提示，一些ASDAS评分较低的AS患者仍可检测出ADA阳性，并需要使用镇痛或助眠药物。这可能与药物浓度不足或ADA触发免疫反应有关。因此，ADA检测可能成为评价ADL疗效的重要补充，为临床医生在传统疾病活动度评分之外提供基于生物标志物的参考。

本研究共收集35份AS临床样本，其中33例获得ASDAS-CRP评分，另2例因缺少CRP数据而无法计算。结果显示，54.3%患者（n=19）ASDAS-CRP<1.3，属于疾病不活动；20%患者（n=7）ASDAS-CRP≥2.1，属于高疾病活动度；其余7例为低疾病活动度。

随后，研究采用本研究建立的CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系统，以及传统ELISA方法检测样本中的ADL浓度和ADA水平。结果显示，回收率分别为80.6%—116.1%和86.7%—116.1%，提示临床样本中具有良好准确性和重复性。该结果与传统ELISA高度一致，相关系数分别为0.9921和0.9936。

由于CRP和红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）常用于评价炎症，研究进一步比较了不同疾病活动度组的这些指标。结果显示，仅CRP水平在疾病不活动组与高活动组之间存在显著差异（p=0.005）。相关性分析进一步显示，ADA水平与CRP水平呈正相关，而ASDAS-CRP评分也与CRP水平相关。这间接提示，ADA水平可能与ASDAS-CRP评分相关，并随ASDAS-CRP升高而升高。因此，血清ADA水平可能作为评价ADL疗效的重要补充指标，为临床决策提供生物标志物证据。

基于上述结果，研究进一步开展2年随访，利用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs系统动态监测3例AS患者血清ADL和ADA水平。结果显示，不同患者之间以及同一患者不同时点之间，ADL和ADA水平均存在明显变化。总体而言，个体内ADL浓度相对稳定或逐渐升高，其中患者1和患者3约为5 µg/mL，患者2约为10—30 µg/mL；相比之下，ADA水平波动更明显。

对于ADA，检测阈值用于区分样本为阳性或阴性，>10 AU/mL定义为阳性，<10 AU/mL定义为阴性。该10 AU/mL阈值基于检测方法验证，并符合美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）监管指南要求。尽管阈值可能随检测方法，如ELISA或增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL），以及疾病类型不同而变化，但>10 AU/mL这一设置已在临床实践中使用超过20年，旨在提供一致且可比的数据以支持治疗决策，并被“阿达木单抗抗药抗体拟议WHO国际生物参考制剂”推荐。

随访显示，患者1基线ADA阳性，患者3为ADA阴性，而患者2在随访过程中由ADA阴性转为ADA阳性，提示ADA免疫原性随时间逐渐增强。患者1基线ADA为11.23 AU/mL，同时使用非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs），剂量为1.2 g/天；10个月后NSAIDs剂量增加至4.0 g/天。患者2初始ADA阴性，为4.63 AU/mL，但10个月后转为阳性，升至21.77 AU/mL。值得注意的是，该患者出现疼痛和睡眠障碍，因此加入中药改善睡眠和缓解疼痛，提示ADL在缓解难治性疼痛和睡眠障碍方面疗效有限。患者3 ADA阴性（<10 AU/mL），除因转氨酶升高使用保肝药物外，未使用其他附加药物。

研究同时收集了3例患者的临床指标。结果显示，患者1在2年随访期间CRP水平和ASDAS-CRP评分持续下降。10个月后，CRP降至正常范围（<0.5 ng/mL），ASDAS由低活动度转为不活动，并保持稳定。患者2和患者3在整个研究期间CRP水平均维持正常，ASDAS-CRP评分提示疾病不活动（<1.3）。然而，值得注意的是，尽管患者2的CRP和ASDAS-CRP显示临床改善，其ADA水平仍持续升高，并伴随睡眠障碍和疼痛加重。这说明ADA水平在临床疗效评估中具有重要补充价值。

因此，定期监测血清ADL水平，例如每3—6个月监测一次，同时监测ADA水平，对于早期发现潜在免疫原性风险十分重要。即使ADL浓度保持稳定、药物暴露充足，患者也可能在某个时间点出现ADA突然升高，提示疗效下降或治疗失败风险。一旦检测到ADA阳性，可及早优化治疗方案，从而提高临床干预效率。考虑到TNF抑制剂治疗费用较高，且患者临床反应差异明显，ADL个体化治疗策略十分必要，可减少治疗不足和过度治疗。为此，研究提出应严格开展ADL谷浓度和ADA的治疗药物监测，以优化药物使用、提高疗效，并最终改善患者结局和生活质量。

图6：33例AS患者临床样本中ADL和ADA水平评估。（a）使用CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs检测ADL和ADA，用于临床疗效评估和治疗干预。（b）高活动度、低活动度和不活动AS患者之间CRP、ESR、ADL水平和ADA水平比较。（c）3例AS患者中ADL和ADA水平的图形化展示。（d、e）3例AS患者常用合并用药和临床参数。统计学方法：在使用Brown–Forsythe检验确认方差齐性后，采用单因素方差分析进行数据分析；p<0.05认为差异具有统计学意义。

【贡献】★★★★★

本研究提出了一种新型双重生物传感平台，可实现ADL和ADA的同步、实时监测，从而回应治疗性mAb管理中的关键难题。为解决传统mAb检测中缺乏特异性识别元件的问题，研究开发了基于F(ab′)2片段的创新正/负双向噬菌体展示筛选策略。该方法成功鉴定出高亲和力肽CP1，可选择性识别ADL，并最大限度减少IgG干扰；SPR验证显示其KD为7.84 µM。

对于ADA检测，研究采用c-scFv片段作为稳定且适应性良好的识别单元。通过整合这些识别元件，研究构建了两种基于AuNPs的生物传感器，即CP1.1@AuNPs和c-scFv@AuNPs，用于快速、定量检测ADL和ADA。将该方法应用于接受ADL治疗的AS患者血清样本后，检测结果表现出良好准确性，并与ELISA结果高度一致（R²=0.99）。

因此，该体系可用于治疗疗效的实时评估和个体化治疗优化。作者认为，这是首个能够同步监测ADL和ADA血药水平的系统，为临床治疗性抗体精准使用提供了新的策略。需要注意的是，本研究主要聚焦ADL/ADA检测平台构建及AS患者样本验证，未来仍需在更大规模、多中心、不同单抗药物和不同疾病人群中进一步验证其临床适用性、标准化阈值和长期治疗决策价值。

免责声明：本公众号尊重并倡导保护知识产权，本文所引述观点、言论、图片及其他信息仅供参考和资讯传播之目的，希望能给读者带来科研的灵感。文章素材来源于Advanced Functional Materials官网原文编译，部分来源在线网站，如涉及版权，联系删除！

【中科院1区｜肝脏与胃肠病学TOP期刊】

【中科院1区｜Cell子刊】

【中科院1区｜材料学TOP期刊】