JACS│近红外四嗪-花菁探针通过生物正交方式用于细胞器膜成像及膜功能的可控破坏

来源：市场资讯

（来源：张崇敬课题组）

大家好，今天分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“Fluorogenic Red to Near-Infrared Tetrazine-Cyanine Probes for Bioorthogonal Organelle Membrane Imaging and Spatiotemporal Disruption”，通讯作者是四川大学华西医院的詹梓炫教授和毛梧宇教授。

INTRODUCTION

细胞器是具有特化功能的细胞区室，各自执行独特的生物学功能。细胞器的边界膜可实现精准的空间分隔，同时细胞器又通过膜接触与物质交换维持动态、广泛的相互通讯，而这些过程均与细胞器膜的形态结构密切相关。

靶向细胞器的荧光探针（包括小分子、纳米材料与蛋白类探针）的开发已取得重大进展。这类探针已被广泛应用于亚细胞动态监测、超分辨成像、生物传感以及靶向治疗等领域。但由于活细胞体系中细胞器膜的标记存在诸多技术难题，目前人们对细胞器膜的生物学特性仍缺乏完整认知。

目前虽已开发出多种小分子细胞器探针，但同时具有实时膜成像、并可破坏细胞器膜的特异性探针仍十分稀缺，相关研究尚不完善。

生物正交化学凭借优异的靶向能力、高生物相容性以及可定制化的功能特性，现已成为生物医学研究中功能强大、用途广泛的技术手段。设计生物正交型光控开启探针（BioTOPs）具有至关重要的意义。这类探针能在预定生物靶标位点发生生物正交反应后，才选择性 “开启” 荧光，该特性既能够精准示踪生物过程，还可通过可激活的光敏效应实现靶标功能的调控。

在众多的技术路线中，四嗪化学凭借反应动力学速率快、反应效率高，且能与结构多样的亲二烯体底物广泛兼容等优势，脱颖而出。四嗪可通过强效荧光淬灭作用直接调控各类荧光团的光学性质，由此催生了一大类荧光生物正交探针。

为构建荧光四嗪探针，早期研究者将四嗪与多种荧光团共价偶联，包括 BODIPY、氮杂 BODIPY、香豆素、荧光素、罗丹明以及硅基罗丹明（SiR）。近期研究重心转向开发荧光四嗪-花菁探针，原因在于花菁染料在光学成像与光治疗领域展现出极具前景的应用潜力。

尽管相关研究已取得进展，但目前荧光工具库（包含靶向细胞器膜的生物正交体系）仍存在较大局限：罗丹明、花菁等主流商用荧光团均带有电荷，限制了其膜靶向能力。传统花菁染料的激发态能级较低，致使四嗪对其淬灭效率不佳。这些缺陷制约了生物正交荧光探针在细胞器膜全景成像与功能操控中的应用。

本文构建了一套通用型红区-近红外四嗪-硼氟花菁荧光探针（TBCy）生物正交平台，可实现细胞器膜成像与膜功能可控破坏 (Scheme 1B、1C）。该分子设计基于四嗪与二氟化硼花菁（BCy）之间的电子耦合效应，既能实现高效荧光淬灭，又可在生物正交反应后快速激活荧光信号。本研究首次系统探究了四嗪与近红外吸收/发射染料的融合构建策略，获得了极高的荧光增强倍数。

Scheme 1. (A) Representative Molecular Structures of Previously Reported Small-Molecular Organelle Membrane Probes; (B) Molecular Structures of Fluorogenic Tetrazine-Fused BF 2-Bridged Cyanine (TBCy) and Schematic Overview of Its Photophysical Properties and Application Potentials; (C) Illustration of Organelle Membrane Imaging and Functional Disruption Enabled by TBCy Probes

将TBCy 探针与各类细胞器膜靶向配体联用后，可实现免洗涤、高特异性的细胞器膜荧光成像。同时，TBCy 探针具备优异光稳定性，支持多通道受激发射损耗（STED）超分辨成像，可直观揭示溶酶体、线粒体与内质网的膜动态变化过程。

此外作者进一步开发了可经生物正交激活的光动力TBCy 探针：光照条件下该探针可条件性破坏溶酶体膜功能，诱发溶酶体膜损伤介导的细胞凋亡，并有效抑制肿瘤生长。

RESULTS AND DISCUSSION

1.红区至近红外荧光 TBCy 探针的理性分子设计

本课题组的前期工作中报道了一类电中性荧光骨架BCy：其光学性质可调控、吸收/发射横跨红区至近红外、荧光亮度高、光稳定性优异，且靶向修饰位点灵活。依托该研究基础，同时基于开发新型荧光四嗪体系的研究目标，作者将四嗪基团共价整合至 BCy 母核的二氟化硼吲哚烯（BFI）结构单元中，强化了二者的空间构型耦合与电子相互作用，由此搭建适用于生物正交标记的红区-近红外致荧光四嗪-花菁（TBCy）探针平台（Scheme 1B）。

为系统阐明 BCy 骨架与四嗪上取代基如何调控 TBCy5 系列探针的光学性能，作者合成了 4 种衍生物：将带有氢/氯取代的BFI 单元，分别与烷基取代、苯基取代的四嗪相连（Figure 1A）。得到 TBCy5 探针后，作者检测了其与双环辛炔（BCN）发生生物正交反应前后的光物理性质。如图 1B、1C 所示，所有TBCy5 探针反应前荧光几乎完全消失，证明四嗪可高效淬灭 BCy 骨架的荧光；发生生物正交激活后，对应 TBCy5 加合物产生极强荧光，荧光强度提升 62～307 倍，荧光量子产率达0.37～0.59。与此同时，探针最大吸收峰蓝移 17～48 nm，证实四嗪与 BCy 骨架间存在高效的空间与电子耦合作用（图 1B、1C，补充图S1）。值得注意的是，四嗪对 BCy5 的荧光淬灭效率与取代基吸电子能力正相关：缺电子苯基取代四嗪、氢取代 BFI 的组合，可强化BCy 母核与四嗪间的电子耦合及淬灭效应；而烷基四嗪、氯化 BFI 衍生物会削弱二者的电子融合与荧光淬灭效果。

Figure 1. (A) Synthetic routes and molecular structures of fluorogenic TBCy probes. (B) Normalized absorption (Blue) and emission (purple) spectra of representative probes before (dotted line) and after (solid line) reacting with BCN in DMSO. (C) Photophysical properties of TBCy BCNadducts, including the peak absorption (λ a abs fluorescence turn-on ratios, and c )/emission wavelengths (λ em ), Stokes shift (Δλ), b maximum molar extinction coefficients (ε max ), quantum yields (Φ). (D) Photophysical pathway of TBCy5−1. (E) Electronic energies of different frontier molecular orbitals in TBCy5−1 during the photoexcitation. (F) Tetrazine fragment extracted from the precursor for calculating the fragment contributions (top), representative example of calculating fragment contribution to the LUMO in TBCy5−3 (middle), and calculated fragment contributions of different molecules to LUMO (ηL), HOMO (ηH), and their difference (Δη; bottom)

作者进一步设计 3 种红区TBCy3 探针、3 种近红外 TBCy7 探针，验证该融合构建策略的普适性（图 1A）。TBCy3 与 BCN 反应生成哒嗪环产物后，吸收光谱蓝移 13～18 nm，证明四嗪与 BCy 骨架实现有效电子融合；其荧光淬灭规律与 TBCy5 系列一致。全部 TBCy3 探针的荧光开启倍数均超过 170 倍（图1B、1C），反应后加合物荧光亮度可达5.1∼14.5×104cm−1M−1（亮度定义为摩尔消光系数 × 量子产率εmax×Φ，图 1C）。

相较于 TBCy3/5，TBCy7 系列探针吸收峰最大蓝移幅度可达 83 nm，吸收峰型发生显著改变；经生物正交激活后荧光开启倍数为中等至优异，为 13～51 倍（图1B、1C）。本研究首次采用融合策略，探究四嗪对发射波长 800 nm 以上染料的光学调控规律。上述结果表明，相比传统花菁染料，电子性质可调的 BCy 荧光骨架更适合通过融合策略构建近红外致荧光四嗪探针。

这类探针的荧光淬灭机制可通过光诱导电荷集中效应（PCC）合理解释。以 TBCy5-1 光激发过程为例：分子存在一个具有分子内电荷转移特征的亮态（振子强度f=2.8029，电荷转移距离Å，图1D、1E）；在该亮态上方 0.134 eV 处存在一个暗态（振子强度f=0.0037），跃迁方式以最高占据分子轨道（HOMO）→次最低空轨道（LUMO+1）为主。

具体来看，HOMO 电子云均匀分布于整个探针分子，而 LUMO+1 电子云高度集中在四嗪片段上，呈现典型电荷集中（CC）特征（电荷转移距离Å，补充表 S1）。分子几何弛豫后，该暗态成为去激发过程中能量最稳定的能级（1.672 eV，图 1D）；LUMO与 LUMO+1 能级差仅 0.169 eV，进一步佐证光诱导电荷集中（PCC）效应的发生（图1E）。因此 PCC 效应可高效淬灭 TBCy5-1 的荧光，大幅降低未反应探针的背景荧光。

作者定量计算了不同探针中四嗪片段对 HOMO 轨道的贡献占比ηH、对LUMO 轨道的贡献占比ηL，以及二者差值Δη（图1F，补充图 S5、S6）。

将 TBCy5-1 左侧基团替换为苯基得到 TBCy5-3 后，Δη由3.595% 升高至 6.298%（图 1F），说明苯基取代增强了四嗪的吸电子能力，促进其与 BCy 骨架的电子相互作用，直观体现为荧光开启倍数从 TBCy5-1 的 62 倍提升至TBCy5-3 的 144 倍。而 TBCy5-4 的Δη进一步升至11.452%，荧光开启倍数高达 307 倍，两项指标均优于 TBCy5-3；该结果证明将氯（Cl）替换为氢（H）可进一步强化四嗪基团的吸电子作用。TBCy7-1、TBCy7-2、TBCy7-3 系列探针也呈现完全一致的变化规律（图 1F）。

2. 适配免洗细胞器膜成像、具备优异生物相容性的 TBCy 探针

作者接着探究了TBCy应用于活细胞内细胞器膜成像的潜力。作者合成了两种 BCN 标签（MemMito、MemLyso）：二者均带有十二烷基链，用于锚定生物膜。另外分别引入三苯基膦（TPP）、N - 甲基哌嗪基（NMP）基团，依次实现线粒体、溶酶体的靶向定位。除此之外，作者还设计了十二烷基修饰的 BCN 标签 MemER，用来靶向内质网（见图 2A）。为进一步提升生物相容性，作者对三款 TBCy 荧光染料进行聚乙二醇（PEG）修饰，得到 TBCy3P、TBCy5P 以及 TBCy7P（见图 2A）。

Figure 2. (A, B) Molecular Structures of biocompatible TBCy3P, TBCy5P, and TBCy7P (A) and organelle membrane-targeted dienophile probes MemMito, MemLyso, and MemER (B). (C−E) Bioorthogonal imaging of mitochondria (B, D) and lysosomes (C, E) labeled with the indicated TBCy probes with (+) or without (−) the preincubated membrane probes, together with the corresponding imaging contrast in labeled and control cells. (F−H) Photostability comparison of TBCy3P vs MTR and TBCy3P vs LTR under continuous laser irradiation. Scale bar = 20 μm.

TBCy 探针对于谷胱甘肽、赖氨酸这两类亲核物质均表现出出色的化学稳定性（见图 S7）。反应动力学测试结果表明，TBCy 探针可以和BCN 快速发生反应，速率常数为3.9 M−1S−1，该反应速率与已发表文献报道的速率水平相近。

细胞毒性实验证实，经过聚乙二醇修饰的 TBCy 探针生物相容性极佳。随后作者测试了这些探针细胞器特异性成像的实际效果：先使用 MemMito 预处理 A549 细胞，再加入 TBCy 探针，借助激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）直接成像，全程无需洗涤操作。时间梯度成像结果显示，45 分钟内荧光强度就基本达到峰值，证明 TBCy 能够在线粒体处快速完成生物正交反应、触发荧光亮起。

所有 TBCy 探针（包含长波长的 TBCy7P）激活之后产生的荧光信号，在活 A549 细胞中均与线粒体绿色商用探针 MitoTracker Green（MTG）高度共定位，皮尔逊共定位系数处于 0.84~0.93 区间，证明探针可以特异性标记线粒体（见图 2B-E）。经MemMito 处理的实验组，荧光强度最高可达未处理细胞的 29 倍（见图 2B-E）。

采用 MemLyso 处理细胞后再孵育 TBCy 探针，即可高对比度地选择性观测溶酶体，荧光增强幅度最高可达 80 倍；借助商用溶酶体绿色探针 LysoTracker Green 开展共染成像进行验证，二者皮尔逊共定位系数处于 0.9~0.95 区间（结果见图 2B-E）。除此之外，选用MemER 作为预靶向组分，成功完成了内质网的荧光标记（见图 S13、S14）。

作为对照实验，预先组装完成的 Pz-BCy5 探针（Pz-1、Pz-2）对线粒体、溶酶体的染色特异性更差（见图 S15、S16）。这一现象说明：在细胞器目标位置原位发生生物正交激活，是实现细胞器靶向标记的关键所在。

接下来作者选用线粒体红色探针（MTR）、线粒体深红探针（MTDR）以及溶酶体红色探针（LTR）这几种商用标准荧光标记作为参照，考察 TBCy 系列探针的光稳定性以及动态成像性能。经 TBCy5P、TBCy3P 处理的细胞，荧光信号衰减速率显著慢于上述参比染料，证明 TBCy 母核具备更优异的光稳定性（见图 2F–H）。持续的高强度光照并不会破坏细胞原有形态，由此证实 TBCy 反应产物光毒性偏低（见图 2G）。反观对照组的MTR 探针，光照会引发严重的光损伤，造成细胞发生皱缩（见图 2F）。凭借出众的光稳定性与极低的光毒性，TBCy 探针可以对活细胞内部的细胞器膜开展长时间、动态化的荧光追踪观测。

3. 细胞器膜的动态多色受激发射损耗（STED）成像

超分辨成像能够在纳米尺度观测活细胞的亚细胞结构，是十分有力的研究手段。为提升探针抗光漂白的能力，作者在 TBCy 分子骨架上引入吸电子氰基取代基，设计得到两款新型探针：TBCy3-CN、TBCy5-CN（见图 3A）。正式开展荧光成像之前，作者先测试了二者经生物正交反应生成产物的光稳定性能。持续光照条件下，Pz3-CN、Pz5-CN 的吸光强度几乎没有发生变化（见图 S18），相较于 Pz3-2、Pz5-2 这两款未引入氰基的对照探针，氰基修饰产物的光稳定性获得显著提升。实验先用 MemLyso 或 MemMito 预处理细胞，再分别孵育 TBCy3-CN、TBCy5-CN，细胞可产生强烈荧光。两套荧光分别和商用溶酶体绿色探针 LTG、线粒体绿色探针 MTG 高度共定位（见图S19）。活细胞层面的光漂白实验进一步证实，经过氰基修饰的 TBCy 探针，稳定性明显优于不含氰基的同源探针（见图 S20）。

Figure 3. TBCy probes for organelle membrane visualization using super-resolution STED microscopy.

接下来作者测试了该探针用于溶酶体膜成像的效果：采用 MemLyso 预处理 A549 细胞，再加入 TBCy3-CN，借助 STED 显微镜完成成像。图像清晰分辨出溶酶体周边大量环状、弧形以及形态不规则的膜精细结构。在 3 号感兴趣区域（图 3B，ROI3），间距仅 120 nm 的两个相邻溶酶体实现了清晰区分，常规共聚焦显微镜无法分辨这类超细膜结构。对溶酶体进行荧光强度剖面分析，得到半峰全宽（FWHM）处于 125–181 nm 区间（见图 3C）。通过时序STED 成像，在 192 s 时长内采集 75 帧图像，捕捉了溶酶体结构的动态重构过程，完整观测到溶酶体接连发生接触穿梭、膜融合、形态圆化、收缩、扩张一系列生理行为（见图 3D）。时序STED图像中标注星号的位置，直观体现出溶酶体膜各处重构幅度并不均一、变化存在异质性。选取部分溶酶体追踪强度随时间的变化曲线，验证了探针优异的光稳定性，强度变化趋势也和观测到的膜重构过程彼此对应（见图 3D、3E、3F）。除此之外，利用 TBCy3-CN 开展内质网的 STED 成像，最终达成了 172 nm 的空间分辨率（见图 3G）。

随后作者选取 A549 细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC），先后使用MemMito、TBCy3-CN 进行孵育处理。A549 细胞的STED 成像清晰勾勒出线粒体膜轮廓。选取放大区域后，可分辨间距 220 nm 的膜结构，该处半峰全宽为 139 nm（见图 3H）。连续时序成像捕捉到线粒体多样的动态形态演变，方框选取区域中观测到线粒体发生融合、拉长、直径缩小等变化；蓝色箭头标记了囊泡状线粒体向管状线粒体发生形态转变的位置。白色方框放大区域清晰呈现出线粒体膜的边界轮廓，沿选定扫描线绘制荧光强度分布，测算得到分辨率可达 156 nm（见图 3H）。在HUVEC 细胞体系中，线粒体膜成像分辨率达到 167 nm，也记录了线粒体持续发生的形态重塑过程（见图 3I）。反观常规共聚焦成像，这两种细胞里上述纳米级膜精细结构都无法被区分开（见图 3H、3I）。得益于出色的光稳定性，探针能够在 127 s、共计 50 帧的拍摄周期内持续动态追踪线粒体膜的形态变化。TBCy5-CN 探针同样表现优异，可以拍出成像质量出色的线粒体膜、溶酶体膜图像。

膜结构之间的动态接触是不同细胞器开展相互通讯的关键环节。现有研究表明，利用互不干扰的多重生物正交化学手段，可以实现多通道荧光标记，进而解析细胞器互作，该方案属于当下前沿的成像策略。已有工作借助 DBCO-SiR、线粒体靶向基团 MAO-N₃，依托应变促进叠氮 - 炔环加成（SPAAC）完成了第一重生物正交标记；在此基础上，作者将 TBCy3-CN 用于另一套互不干涉的正交标记体系，仅采用单束 775 nm 淬灭激光就完成 STED 成像，动态追踪线粒体与溶酶体二者的相互作用（见图 3J、3L）。时序成像捕捉到溶酶体膜的动态形变，以及溶酶体、线粒体之间短暂接触、彼此靠近、后续分开的瞬时互作过程（见图 3J、补充视频 S3）。除此之外，将TBCy3-CN 和适配 STED 成像的 LDBCy5 探针搭配联用，实现时长超过 150 s（采集 30 帧）的长时间多通道超分辨观测，动态追踪脂滴与溶酶体之间的相互作用（见图 3K）。

4. 生物正交可激活的细胞器膜破坏

精准调控细胞器膜能够有效调控细胞命运，具备广阔的研究应用前景。然而，可直接扰动细胞器膜结构的小分子探针目前还十分稀缺。考虑到 TBCy 骨架能够按需完成活化，作者将原有结构上的氯原子替换为溴原子，设计得到 TBCy5-Br 探针，借助生物正交的可控激活特性，用光诱导破坏细胞器膜。由于溶酶体结构破损是决定细胞走向何种命运的关键环节，作者选用 TBCy5-Br 开展溶酶体相关调控实验。先用 MemLyso 预处理细胞，再孵育 TBCy5-Br，A549 细胞内部的溶酶体就能够被特异性标记；而仅单独加入 TBCy5-Br 的对照组，细胞荧光信号十分微弱。CCK-8 细胞增殖检测结果显示，只有第 6 实验组（先后使用MemLyso、TBCy5-Br 处理并且进行光照）的细胞增殖受到显著抑制，仅需浓度 0.5 μM 的 TBCy5-Br 就可以达成理想的细胞毒效果（见图 4C）。

Figure 4. Bioorthogonally activatable lysosomal membrane photodamage and the associated downstream biological responses.

作者先后采用钙黄绿素 AM / 碘化丙啶（Calcein-AM/PI）活死双染、膜联蛋白 V / 碘化丙啶（Annexin V/PI）染色结合流式细胞术进行验证，证实光疗可以有效杀伤细胞。采用活性氧（ROS）特异性探针 2',7'- 二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探究细胞死亡背后的作用机制，流式细胞检测表明依旧只有第 6 组出现明显增强的荧光信号。这证明 TBCy5-Br 完成生物正交活化之后，能够在光照条件下实现时空可控的活性氧生成，由此高效诱导细胞凋亡（见图 4D、4E）。

接下来为了确认光照诱发的溶酶体膜破损正是细胞死亡的起始诱因，作者开展了系统性验证实验。先完成分步生物正交反应再光照，随后进行吖啶橙（AO）染色，观察发现溶酶体内部的橙色荧光出现明显下降。这一现象说明溶酶体膜通透性提升（LMP，溶酶体膜通透化）、膜结构受损，原本储存在溶酶体内的吖啶橙渗漏进入细胞质基质（见图 4E、4F）。

作者进一步借助组织蛋白酶 B（CTSB）的底物 ZRR-AMC 检测蛋白酶活性，再次佐证上述结论：组织蛋白酶 B 可以水解底物 ZRR-AMC、产生带荧光的氨基香豆素，细胞质当中该产物的荧光强度提升至原先的 1.7 倍，意味着组织蛋白酶 B 从破损的溶酶体内渗漏出来，证实溶酶体膜通透化程度出现明显加剧。依托 BODIPY C11 探针检测脂质过氧化（LPO）水平可以发现，光照处理之后探针的绿色荧光显著变强。分布固定于溶酶体膜上的 BCy 衍生物光照产生单线态氧，单线态氧进一步氧化膜上的多不饱和脂肪酸（PUFAs），快速拉高脂质过氧化水平（见图 4E、4G）。

作者设置对照实验：对照组选用 Pz5-Br（TBCy5-Br 的预反应加合物）、BCN-Lyso（不具备膜靶向能力的探针）。共聚焦成像结果表明，Pz5-Br 无法特异性标记溶酶体，二者共定位系数仅为 0.36（见图 4H）。CCK-8 细胞增殖检测结果显示：相较最优实验组（MemLyso+TBCy5-Br + 激光照射），BCN-Lyso+TBCy5-Br + 激光组、Pz5-Br + 激光组几乎没有产生细胞毒性，活/死细胞染色的检测结果也印证了这一点（见图 4I）。上述两组处理不会造成吖啶橙（AO）、组织蛋白酶 B（CTSB）发生渗漏，说明这两种对照组处理下溶酶体膜完整性完好（见图 4J、4K）。同时对照组脂质过氧化（LPO）水平也没有出现上调（见图 4L）。综上可知，这套预靶向策略带来的膜锚定效果，能够更加精准、有效地实现细胞器膜的可控破坏。

为进一步探明生物正交光激活造成溶酶体损伤后后续的细胞死亡通路，作者选取关键生物标志物开展免疫荧光以及蛋白质免疫印迹（Western blot）检测。借助各类损伤相关分子模式（DAMPs）探究免疫原性细胞死亡（ICD）进程，重点考察两个标志性指标：钙网蛋白（CRT）在细胞膜表面的暴露程度、高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）向胞外的释放水平。免疫荧光成像结果显示，第 6 实验组的钙网蛋白出现显著的膜表面暴露并且该组 HMGB1 释放量明显上升，其余实验组这两项指标几乎没有发生明显波动（见图 4M）。蛋白质免疫印迹检测发现，第 6 组谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达量大幅下调，同时半胱天冬蛋白酶 3（caspase-3）被活化，这说明铁死亡、依赖溶酶体调控的细胞死亡通路均在此过程中发挥作用。

除此之外，溶酶体功能发生紊乱，细胞自噬流运转受阻：LC3-II 蛋白以及 p62 蛋白出现堆积，可佐证自噬通量的受损（见图 4N）。

综合所有实验结果能够得出结论：生物正交光激活引发的溶酶体膜通透化处于整个级联反应的上游核心位置，它一方面造成了膜的氧化损伤，另一方面启动了多条依托溶酶体的细胞死亡通路，多重机制协同发力，最终促使细胞发生不可逆死亡。

Figure 5. (A, B) In vivo fluorescence images and corresponding intensity analyses of A549-tumor-bearing mice after intratumoral injection of TBCy5-Br or TBCy5-Br combined with MemLyso. (C) Photographs of excised tumors collected from A

体外实验取得理想结果之后，作者进一步开展体内实验，探究 TBCy5-Br 借助生物正交可控破坏溶酶体膜所实现的抗肿瘤效果，以此验证在复杂的活体生物环境当中，这套生物正交激活策略具备可行性，完成概念验证。

对荷瘤小鼠依次注射 MemLyso、TBCy5-Br 后，肿瘤部位荧光强度大约达到单独施用 TBCy5-Br 组别荧光强度的 3.6 倍。本研究搭建A549 移植瘤小鼠模型，评估该体系在活体层面可经生物正交触发的光疗杀伤效果（见图 5A、5B）。肿瘤体积统计结果表明：采用 MemLyso+TBCy5-Br 联合激光照射处理的实验组肿瘤消退效果最为显著，实验末期肿瘤体积最小；其余对照组的肿瘤则始终处于持续生长的状态（见图 5C、5D）。上述实验结果证明，借助生物正交手段可控破坏溶酶体膜，是一项具备良好应用前景的活体肿瘤治疗方案。

总 结

本研究报道了一种四嗪-花菁（TBCy）荧光探针的稳健生物正交平台：通过将四嗪基团引入可调控的 BF₂桥接花菁（BCy）骨架中，开发了一套通用的细胞器膜标记策略。

TBCy 探针具有优异的荧光响应性、出色的光稳定性、红 - 近红外吸收 / 发射特性，且呈电中性。结合理性设计的细胞器膜靶向探针，生物相容性 TBCy 衍生物可实现对溶酶体、线粒体及内质网膜的免洗、高特异性标记。这一特性支持多色超分辨 STED 成像，并可对细胞器膜的动态过程进行实时追踪。此外，通过生物正交激活，光敏化的 TBCy 可在光照下对溶酶体膜进行时空可控的精准破坏，进而诱导溶酶体膜损伤触发的细胞死亡。

本研究不仅为细胞器膜功能的解析与调控提供了通用工具库，也拓展了荧光型四嗪探针在精准生物成像与治疗领域的设计思路与应用范围。

文献整理：Linhao

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c06546