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成功构建人工蛋白“步行器”：可沿DNA轨道定向行走

自然界的蛋白质马达一直是生命科学中令人着迷的精密机器，它们能够将化学能转化为机械功，以惊人的效率和精确性完成生命活动。然而，设计并实现一个能够定向移动的人工蛋白马达，一直是合成生物学和纳米技术领域长期未能攻克的核心挑战。 尽管近年来在DNA和小分子马达方面取得了进展，但借助蛋白质从头设计来构建具有持续定向运动能力的人工蛋白马达仍然困难重重，难点在于如何将具有不同功能的柔性蛋白组件耦合并协调起来，使其在结合表面和定向运动的同时实现能量转换。

近日，‌澳大利亚新南威尔士大学Paul M. G. Curmi教授和瑞典隆德大学Heiner Linke教授合作，报告了他们成功构建的一种名为“风滚草”（简称TW）的人工蛋白步行器。 该蛋白能够在外部配体控制下，沿DNA轨道进行方向性的16纳米步进运动。通过模块化设计策略，研究团队将多个本身不具备马达功能的已知蛋白元件组合在一起，使整个复合物表现出超越各个组件简单相加的涌现功能。结合单分子荧光技术与可编程微流控装置，该团队不仅实现了对TW步行方向和速度的精确控制，还通过动力学模拟验证了其作为化学能驱动布朗棘轮的运行机制——TW的每一步依赖于热驱动的扩散运动，而配体的顺序交换提供自由能来打破对称性，从而实现净定向运动。相关论文以“Clocked stepping of an artificial protein walker along a DNA track”为题，发表在Nature Nanotechnology上。

该人工蛋白步行器的核心设计思路包含三个关键概念（图1）。首先，TW拥有三条“腿”，每条腿均由不同的阻遏蛋白构成，它们只有在各自对应的配体分子存在时才能特异性结合DNA轨道上的特定序列。这三个足部分别是识别色氨酸的TrpR、识别钴离子的DtxR以及识别S-腺苷甲硫氨酸的MetJ。这些足部通过柔性连接区与α螺旋卷曲螺旋结构的“腿部”相连，最终汇聚于一个中心的SpyTag/SpyCatcher连接枢纽，形成一个三足结构（图1a）。其次，为了确保单向运动，DNA轨道上按照“trpR-dtxR-metJ”的特定顺序排列了这些蛋白的结合位点，并且通过设计位点间距，保证TW在任何时刻只有相邻的两个足能够同时结合到轨道上，而无法同时接触非相邻位点（图1b）。最后，TW的运动由外部配体溶液的循环切换来控制。通过按顺序将TW浸泡在（色氨酸+钴离子）、（钴离子+SAM）和（SAM+色氨酸）三对配体溶液中，步行器会依次以“TrpR-DtxR”、“DtxR-MetJ”和“MetJ-TrpR”三种双足结合状态沿轨道前进，从而完成一个完整的步进周期（图1c）。

图1 | TW人工时钟控步行蛋白概念。 a，我们从两个同源二聚体蛋白TW1和TW2构建了TW。TW1包含DtxR阻遏蛋白、一个geminin螺旋和SpyCatcher蛋白。TW2包含TrpR阻遏蛋白、一个geminin螺旋、SpyTag、另一个geminin螺旋和MetJ阻遏蛋白。通过SpyTag/SpyCatcher系统共价组装TW1和TW2。b，为实现单向运动，我们使用了包含TW三个足部各自同源结合位点（以对接状态显示）的有序序列的DNA轨道：trpR-dtxR-metJ，该序列可无限重复，并排列使TW保持在轨道的同一面。c，通过时间依赖性地将TW浸泡在配体溶液中来控制定向运动。在色氨酸存在下（上图；Trp，蓝色三角形），TW通过TrpR足（青色）结合。加入Co²⁺（粉红色方块，自上而下第二图）后，DtxR足（品红色）也结合到与TrpR足相邻的轨道上。当Trp浓度降低时（自上而下第三图），TrpR足从轨道上释放。加入S-腺苷甲硫氨酸（自上而下第四图；SAM；橙色圆圈）后，MetJ足（棕色）结合到与DtxR足相邻的位置。当Co²⁺浓度降低时（自下而上第二图），DtxR足释放。最后，重新加入Trp后，TrpR足结合到与MetJ足相邻的位置（底图）。注意，TW和轨道的设计使得每个结合足只能到达一个位点（例如，底图中的近端而非远端的trpR位点）。

研究人员对TW的组装和结构进行了全面表征。他们分别表达并纯化了TW的两个组分TW1和TW2，通过SpyTag/SpyCatcher系统共价连接形成完整的TW蛋白，并利用尺寸排阻色谱和质谱光度量法确认了其准确的分子量（图2a,b）。通过小角X射线散射分析，他们发现TW在溶液中呈现柔性构象，最佳拟合结果表明其存在两种主要构象：一种为L形，另一种为伸展状态（图2c）。原子力显微镜图像清晰地显示，在色氨酸存在下，8个TW蛋白能够均匀地结合在含有8个重复结合位点的线性DNA轨道上，且结合位置与插入片段的预期位置完全一致，通过测量两侧侧翼DNA的轮廓长度得到了确认，验证了轨道设计的有效性（图2d）。

图2 | TW的组装与表征。 a，SDS-PAGE显示共价TW组装及SEC纯化后的TW（TW尺寸排阻纯化后）。所有后续实验均使用TW尺寸排阻纯化后的蛋白。b，纯化的TW1、TW2和TW的质谱光度量表征。插图：每种蛋白物种的理论和观测分子量（平均值±标准误，n=4）。c，TW的SEC-SAXS分析。右上图为SAXS强度作为q（以Å⁻¹为单位的动量传递）的函数。插图：数据的Guinier图；使用Multi-FoXS程序将数据拟合到构象集合。最佳拟合（右上图，红线）由χ²确定，使用两种构象体，一种为L形（模型1，左上）和一种为伸展状（模型2，左下），权重分别为0.725和0.275。误差加权残差图（右下图）显示模型与实验数据之间没有显著的系统偏差。d，AFM图像显示在Trp存在下，八个TW结合到插入侧翼序列之间的八个重复的metJ-trpR-dtxR轨道上。

为了验证TW各足部的结合特异性，研究团队利用表面等离子体共振技术进行了细致的亲和力测定（图3a）。结果表明，在没有配体的情况下，TW与DNA的结合极弱；而只有在添加了对应配体后，相应的足部才会高特异性地结合其目标DNA序列，表观解离常数Kd在8-27 nM范围内（图3b），并且每个TW蛋白仅与一个DNA分子形成1:1的复合物（图3c）。重要的是，TW在双位点DNA上只有在两种对应配体同时存在时才能形成稳定的双足结合状态。动力学实验揭示，单个足部在去除配体后的解离半衰期不到4秒，而在双配体存在下的双足结合状态半衰期则长达至少30-50秒（图3d）。这种巨大的时间尺度差异为通过顺序切换配体来实现可控步进提供了关键的动力学窗口。

图3 | 优化TW：DNA轨道相互作用。 a，SPR传感图面板，将5nM、10nM、20nM、40nM和80nM的TW滴定到含有单个同源位点（metJ、dtxR和trpR位点）的DNA寡核苷酸上，在存在或不存在控制配体的情况下，显示TW的每个足部（在配体存在下）与其同源DNA的预期结合，且非特异性结合极低。b，代表性结合曲线，将平均稳态SPR响应拟合到Hill方程。曲线显示TW（圆圈）和单个阻遏蛋白二聚体（三角形）在控制配体存在下与含有单个同源位点（棕色，metJ；品红色，dtxR；青色，trpR）的单一位点轨道的结合。c，质谱光量数据比较TW与含有metJ和trpR位点的双链DNA复合物在无配体（灰色）和存在SAM和Trp（橙色）时的估计分子质量分布。无配体时观测到的128±2 kDa（平均值±标准误）和存在SAM与Trp时观测到的183±3 kDa的分子质量分别与理论质量133 kDa和183 kDa高度一致。d，不同TW：DNA复合物的表观半衰期，由SPR实验拟合的k_off值计算得出，TW在配体存在（实心圆）或去除后（空心圆）与DNA结合。通过加入过量游离竞争性特异性DNA在配体存在或不存在的情况下触发解离。控制配体对应各自的DNA轨道，如图所示。圆圈代表重复实验的各个值。

单分子FRET实验是验证TW定向步进的核心（图4a-c）。研究人员设计了一条包含四个结合位点的DNA轨道，并在轨道两端的trpR位点上标记了不同的FRET受体，同时将荧光供体标记在TW的TrpR足部。这样一来，根据TrpR足结合在轨道底端、中间还是顶端，系统会分别发出不同波长的荧光信号。实验一结果显示，随着微流控设备中配体溶液的周期性切换（图4d,e），数百个单个TW分子的荧光信号呈现出同步的、反相位的交替变化（图4f-i），清晰地表明TrpR足部按照配体指令反复结合和解离，证明TW确实在沿着轨道行走（图4g-i）。

图4 | 单分子FRET实验1：TW在配体变化响应下沿DNA轨道步进。 TW行走实验在一个四联位点（从底部到顶部为trpR-dtxR-metJ-trpR）DNA轨道上进行，该轨道通过生物素-链霉亲和素连接固定在生物素化PLL-g-PEG钝化表面。底部和顶部的trpR位点分别用不同的FRET受体（ATTO565和ATTO647N）标记。TrpR足部用FRET供体Alexa Fluor 488（绿色发射体）标记。a-c，我们预期在配体对存在下形成的TW：DNA复合物：a中为Trp+Co²⁺，b中为SAM+Co²⁺，c中为SAM+Trp。这三个复合物中的每一个在488nm激光激发时都设计为产生不同的荧光信号：当TrpR足结合到底部trpR位点时FRET至ATTO565（发射峰590nm）（a），自由TrpR足的Alexa Fluor488发射（发射峰525nm）（b），以及当TrpR足结合到顶部trpR位点时FRET至ATTO647N（发射峰664nm）（c）。使用543nm发射分光进行双色成像，同时记录Alexa Fluor488发射（绿色显示）和ATTO565加ATTO647N发射（品红色显示）。d，控制溶液及其随时间交换的方式：Trp+Co²⁺（TC）、SAM+Co²⁺（SC）和Trp+SAM（TS）。e，d中控制溶液对应的TW在DNA轨道上预期位置的示意图。f，e中TW：DNA复合物预期的荧光信号。g，来自单个视野的所有322个检测到的共定位单分子的Kymograph，按最后一次检测到的荧光时间排序。h，归一化的单分子轨迹示例。i，kymograph g中所有单分子轨迹的总和。

在第二个单分子实验中，研究人员将两个FRET受体的发射光分别成像到不同通道，以明确区分TW是结合在轨道的顶端还是底端（图5a-c）。结果再次显示，荧光信号与配体切换完美同步（图5d-f），TW能够在轨道两端之间往复运动（图5g-i）。通过分析大量单分子轨迹，他们发现TW的TrpR足部约有65%±8%的时间正确结合到预期的相邻trpR位点，而约有35%±6%的时间会“超步”——即跳过中间位点直接结合到更远的同一位点（无论是向前还是向后）。这种随机过步行为在天然生物马达如肌球蛋白和驱动蛋白中同样存在，是随机热力学所预测的分子马达基本特征之一。

基于实验测得的结合与解离速率以及观察到的35%过步概率，研究人员建立了粗粒化动力学模型。模型模拟结果很好地重现了实验中的单分子荧光轨迹，并预测在无限长的DNA轨道上，TW每完成一个完整的三步配体循环（约21秒）可前进约0.4个轨道周期（一个轨道周期为49纳米），对应速度约为0.93纳米/秒。在发生光漂白或TW完全解离前，单个TW平均可连续行走约3至6步，覆盖约50至100纳米的距离。

图5 | 单分子FRET实验2：TW访问DNA轨道的两端。 a-c，使用与图4相同的四联位点DNA轨道和荧光标记，但使用633nm发射分光进行双色成像，同时记录ATTO565发射和ATTO647N发射。通过这种方式，我们可以区分TW TrpR足是结合到顶部trpR位点（a，FRET发射峰664nm，品红色显示）还是底部trpR位点（c，FRET发射峰590nm，青色显示），而中心位置具有自由TrpR足（b）预期记录为暗色。d，控制溶液及其随时间交换的方式：Trp+Co²⁺（TC）、SAM+Co²⁺（SC）和Trp+SAM（TS）。e，这些时间点TW在DNA轨道上预期位置的示意图。f，d中状态对应的TW：DNA复合物预期的荧光信号。g，来自四个视野的所有236个检测到的共定位单分子的Kymograph，按最后一次检测到的荧光时间排序。h，归一化的单分子轨迹示例。i，kymograph g中所有单分子轨迹的总和。

这项研究成果不仅首次实现了由非马达蛋白模块组装而成的人工定向蛋白步行器，更为开发完全自主运行的人工蛋白马达奠定了关键基础。 该模块化设计策略绕过了从头设计具有复杂动态特性的蛋白的固有难题，证明了通过组合和整合已知功能域来获得涌现特性的可行性。这一人工步行器也为研究纳米尺度马达的能量效率、精确性与速度之间的物理权衡提供了一个理想的实验平台。随着DNA轨道刚性的进一步优化和微流控切换时间的缩短，该人工蛋白马达的性能有望进一步接近天然蛋白马达，为未来构建复杂、动态的蛋白基纳米机器开辟了全新道路。