《JACS》同济大学吴青/王启刚/岳锐：全天然水凝胶有效延缓软骨退变！

在组织工程与再生医学领域，实现对软组织缺损处的快速、微创、有效填充一直是一个核心挑战。理想的填充材料应具备良好的生物相容性、力学适配性和组织整合能力。可注射水凝胶因其可微创递送并原位成型而备受关注，但现有体系存在明显不足：物理交联水凝胶力学性能较弱，难以在动态受力环境下维持稳定；而化学交联水凝胶常需引入外源性引发剂、自由基或光照条件，可能造成组织损伤，且不可逆网络缺乏动态适应性。近年来，动态共价化学通过可逆键的断裂与重组赋予材料能量耗散和自修复能力，为水凝胶设计提供了新思路。在天然组织中，类似的动态交联过程往往由酶精确调控，这提示酶介导策略可能成为构建仿生水凝胶的有效途径。然而，如何在生理条件下，不依赖有毒中间体或复杂预修饰，利用酶催化快速构建兼具力学稳定性、组织粘附性和生化调控功能的全天然水凝胶，仍是该领域亟待突破的关键技术难题。

基于以上研究背景，同济大学附属上海市第四人民医院吴青团队，联合同济大学化学科学与工程学院王启刚、生命科学与技术学院岳锐团队，共同开发了一种半乳糖氧化酶（GAO）与过氧化氢酶（CAT）双酶介导动态席夫碱交联策略，用于构筑全天然水凝胶。该策略以天然半乳甘露聚糖同时作为凝胶骨架组分与酶反应底物，无需外源引发剂、不产生自由基、无需化学预修饰，即可实现水凝胶快速原位成型；所得水凝胶兼具优异的组织粘附性、力学适配性及氧化还原调控性能。在骨关节炎（OA）小鼠模型中，经单次关节腔注射即可有效延缓软骨退变、抑制骨赘生成并减轻滑膜炎症，同时可快速填充软组织缺损、促进组织再生修复。相关内容以“Multienzyme-Mediated Dynamic Cross-Linking of All-Natural Hydrogels with High Adhesion and Redox Modulation for Rapid Tissue Filling and Repair”为题发表在《Journal of the American Chemical Society》上。

图1 多酶介导的半乳甘露聚糖与乙二醇壳聚糖的动态席夫碱交联用于原位形成多糖水凝胶及组织填充应用

主要内容

不同结构的半乳甘露聚糖在GAO/CAT催化下表现出明显差异的凝胶化能力。通过FTIR、¹H NMR和醛基滴定分析，瓜尔胶、塔拉胶和刺槐豆胶都能够被成功氧化生成醛基并发生席夫碱交联形成水凝胶，而具有高密度半乳糖侧链的葫芦巴胶则因氧化不充分无法成胶。其中瓜尔胶具有最高的醛基取代度和良好的力学性能，被选为后续研究的代表性体系。

图2 半乳甘露聚糖的酶促氧化用于通过动态交联实现温和凝胶化

凝胶化速度和力学性能是评价水凝胶实用性的关键指标。通过系统表征显示，优选出的瓜尔胶基水凝胶在37°C下可在11秒内快速凝胶化，网络孔径在5至42微米范围内可调，压缩模量在0.42至4.99 kPa之间可控，同时表现出剪切变稀、自愈合和优异的润滑性能，其摩擦系数显著低于临床常用的透明质酸钠润滑剂。值得注意的是，XPS和断面SEM分析揭示，在外力作用下原本被席夫碱交联网络固定的酶能够被重新暴露并恢复催化活性，持续氧化残留的半乳甘露聚糖生成新的醛基，从而动态增强水凝胶与软骨组织界面的共价粘附。

图3 GC@GAO/CAT水凝胶的表征

除了力学适应性，该水凝胶的酶活性与抗氧化能力同样值得关注。包埋的GAO和CAT在固定化后仍保持较高的催化效率，长期储存稳定性显著优于游离酶。其中GAO经WST-8显色法证实具有类超氧化物歧化酶活性，能够催化清除超氧阴离子。两者协同作用赋予水凝胶高效清除多种活性氧（ROS）和活性氮（RNS）物种的能力，在骨关节炎患者滑液样本中分别实现了约60%的ROS清除率和约31%的RNS清除率。

图4 GC@GAO/CAT水凝胶的催化活性、类SOD活性及ROS/RNS清除能力

在细胞层面，该水凝胶的生物相容性和抗炎保护作用得到验证。CCK-8测试显示其在100 mg/mL高浓度下仍无细胞毒性。荧光探针染色和qPCR结果表明，水凝胶能够显著抑制脂多糖诱导的巨噬细胞内ROS和RNS的生成，并下调IL-6和TNF-α的mRNA表达水平。免疫荧光染色进一步观察到，水凝胶处理可促进巨噬细胞从促炎的M1表型向修复性的M2表型极化。

图5 GC@GAO/CAT水凝胶在细胞水平的多酶协同氧化还原调节与抗炎能力

动物实验进一步验证了该水凝胶的体内治疗效果。在小鼠骨关节炎模型中实施单次关节腔注射治疗，结合番红O/固绿染色、OARSI评分、骨赘评分、滑膜炎评分和Col II免疫荧光染色进行组织学评估，水凝胶治疗组关节软骨表面更加光滑完整，蛋白聚糖保留良好，OARSI评分显著低于PBS对照组。同时骨赘形成和滑膜炎症增生均得到有效抑制，Col II蛋白表达水平恢复至接近正常健康小鼠的水平。

图6 GC@GAO/CAT水凝胶在小鼠骨关节炎模型中的体内治疗效果评估

分子机制探究揭示了该水凝胶治疗骨关节炎的深层原因。免疫组织化学染色发现，水凝胶治疗组关节软骨和滑膜中IL-6、TNF-α和氧化应激标志物8-OHdG的表达水平显著降低，这一趋势在大鼠OA模型中通过ELISA得到进一步验证。转录组分析显示，与PBS对照组相比，水凝胶治疗组中下调的基因主要富集在钙信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及HIF-1信号通路。此外，血常规、肝肾功能指标及主要器官H&E染色均未发现异常，证实该水凝胶具有良好的体内安全性。

图7 GC@GAO/CAT水凝胶在关节组织中抗炎、抗氧化应激的分子机制验证

全文总结

本研究成功建立了一种底物集成、多酶催化的动态共价交联策略，构建了全天然、可注射、自愈合、高粘附且具有抗氧化功能的GC@GAO/CAT水凝胶。该水凝胶能够在生理条件下快速原位凝胶化，具备可调的力学性能、优异的润滑性和力响应性界面粘附能力，同时其内置的GAO/CAT酶系统通过协同作用高效清除ROS和RNS，调控氧化还原微环境，抑制炎症反应并促进巨噬细胞M2极化。在骨关节炎小鼠和大鼠模型中，单次关节腔注射该水凝胶即可显著缓解软骨退化、骨赘形成和滑膜炎，且具有良好的生物安全性和系统性相容性。这一策略为软组织填充和再生医学提供了一种安全、简便、无需外源引发剂的通用平台，展现出广阔的临床转化前景。

文献链接：

https://doi.org/10.1021/jacs.6c01567