《BM》华科杨光/石志军/陈红：可注射水凝胶修复脊髓损伤新策略!

脊髓损伤（SCI）每年全球新增25万至50万例患者，每位患者终生医疗费用高达100万至500万美元，给家庭和社会带来沉重负担。然而，目前仍缺乏有效疗法。细胞移植虽具潜力，但面临移植细胞在损伤部位存活率低、整合困难的核心瓶颈。

近期，华中科技大学杨光教授联合陈红教授团队在Bioactive Materials发表研究论文，构建了一种可注射、自适应的OHA-CMCS双网络水凝胶，并首次将其与人干细胞来源的脊髓V3中间神经元前体细胞联合应用。该系统在完全性脊髓横断大鼠模型中，通过“材料引导+细胞执行”的双引擎协同，显著促进了运动功能和膀胱功能的恢复。

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研究内容简介

一、仿生设计：水凝胶精准模拟天然脊髓

研究团队采用氧化透明质酸（OHA）和羧甲基壳聚糖（CMCS），通过动态席夫碱反应构建了水凝胶。该材料具备多项关键特性：力学匹配：储能模量约103.8 Pa，与天然脊髓组织（100-3000 Pa）高度一致，为神经干细胞向神经元分化提供“软”基质信号。快速自愈合：被切断后约2分钟内可自主修复，赋予材料注射后结构重塑能力，适用于微创植入。适宜降解：28天后仍保留51.7% 的残余质量，可为组织再生提供中长期稳定支撑。高含水量：平均含水量超过95%，有利于营养交换和细胞生存。这些特性使水凝胶不仅能填充不规则损伤空腔，还能为移植细胞提供物理保护和生化支持。

图1：可注射自愈合水凝胶联合V3神经元治疗脊髓损伤的示意图。本图示意了OHA-CMCS水凝胶的构建及其与V3细胞治疗协同修复脊髓损伤的机制。OHA-CMCS水凝胶由氧化透明质酸与羧甲基壳聚糖通过动态席夫碱反应交联形成。该水凝胶的力学性能与天然脊髓组织匹配，并在体外三维培养中有效支持人源脊髓V3神经前体细胞的存活、分化与成熟。在大鼠脊髓损伤模型中，移植的OHA-CMCS水凝胶与V3细胞形成协同治疗系统：该系统通过填充损伤空腔提供结构支撑，为修复奠定基础；同时，通过抑制神经炎症与胶质瘢痕形成、促进血管生成以改善局部微环境，并显著提升移植V3细胞的存活与整合效率等多重主动机制驱动修复进程。这些机制的协同作用最终成功促进了轴突再生与髓鞘修复，显著改善了大鼠后肢运动功能与膀胱功能。

图2：OHA-CMCS水凝胶的表征 (A) OHA-CMCS水凝胶的扫描电镜图像。比例尺：400 μm。(B) HA与OHA的红外光谱图。(C) HA与OHA的¹H-NMR谱图。(D) CS与CMCS的红外光谱图。(E) CS与CMCS的¹H-NMR谱图。(F) OHA-CMCS水凝胶的红外光谱图。(G) 不同水凝胶在固定频率（1 Hz）和1%应变下的时间扫描流变学分析。(H) 不同水凝胶的频率扫描流变学测试（0.1–10 rad/s）。(I) 不同水凝胶在PBS中的溶胀率（n = 3）。(J) 不同水凝胶的体外降解曲线（n = 3）。(K) OC水凝胶在固定频率1 Hz下的应变振幅扫描（0.1–1000%）。(L) OC0.33水凝胶在固定频率1 Hz下，于低应变（1%）和高应变（600%）间振荡的步进应变测试。(M) 自愈合机制中动态共价键的示意图。

二、精准分化：OC水凝胶支持V3神经元的功能成熟

体外共培养实验证实，OC0.33水凝胶不影响V3前体细胞的分化与成熟。将细胞包埋于水凝胶培养7天后，细胞呈现典型神经元形态（图3A）。免疫荧光染色显示，水凝胶组细胞高表达成熟神经元标志物MAP2和V3特异性谷氨酸能标志物VGLUT2，且信号高度共定位（图3B-C）。定量分析表明，水凝胶组与对照组在MAP2和VGLUT2荧光强度上无显著差异（p > 0.05，图3D-E），证明OC水凝胶不干扰V3前体细胞向成熟功能神经元分化的正常进程。

图3：OC水凝胶促进人源脊髓V3神经前体细胞的分化与成熟 (A) 培养第1、3、5、7天时，OC0.33水凝胶组与对照组中V3中间神经元形态的代表性图像。比例尺：100 μm（第1天），50 μm（第3–7天）。(B) 细胞经成熟神经元标志物MAP2（红色）和V3特异性谷氨酸能标志物VGLUT2（绿色）染色的免疫荧光图像。比例尺：50 μm。(C) 图(B)中方框区域的高倍放大图，显示细胞内MAP2与VGLUT2的精细空间共定位。比例尺：20 μm。(D, E) (D) MAP2和(E) VGLUT2荧光强度的定量分析（n = 3）。

三、联合治疗显著促进长期运动功能恢复

研究团队在大鼠完全性T9脊髓横断模型中进行了长达16周的观察（图4A）。联合治疗组（OC0.33+V3）的生存率保持在100%（图4B）。BBB评分（运动功能评分）在16周时达到7.8分，显著高于单独治疗组和损伤组，部分动物达到9分（图4D-E）；后肢抓力恢复至321.0克，电生理检测的肌肉动作电位振幅显著提高至12.5 mV，潜伏期明显缩短（图4F-K），提示神经信号传导通路得到有效重建。

图4：OC0.33水凝胶与V3神经前体细胞联合治疗促进大鼠脊髓损伤后长期运动功能恢复 (A) 大鼠脊髓损伤模型及治疗流程示意图。(B) 术后16周内各组大鼠的生存率。(C) 体重动态变化。(D) 大鼠BBB评分变化。实验结束时各组大鼠数量：SCI组（n=7），OC0.33组（n=6），V3组（n=9），OC0.33+V3组（n=9）。(E) 第16周时各组最终BBB评分的分布。(F) 后肢抓力的定量分析（n=5）。(G) 第16周水平梯测试中有效步态比例的定量分析（n=5）。(H) 第16周后肢步态模式的代表性图像。(I) 各组记录的复合肌肉动作电位（CMAP）代表性波形。(J, K) 各组(J) CMAP振幅和(K) 潜伏期的定量分析（n=5）。

四、移植V3神经元整合入宿主神经环路

STEM121人源细胞标记显示，水凝胶将损伤中心移植细胞的存活率提高了约4.9倍（图5A-B）。存活的人源细胞中高比例共表达成熟神经元标志物NeuN（图5C），且损伤周围区域SYP阳性面积显著增加（图5D-E），表明移植细胞已分化为成熟神经元并接受突触输入。化学遗传学实验进一步证实：当用DCZ激活移植神经元时，运动功能保持高水平；而当用SalB抑制其活性后，后肢抓力和有效步态率显著下降（图5F-H），直接证明移植的人源V3神经元已成功整合入宿主脊髓神经网络并驱动功能恢复。

图5：移植的人源V3神经元在体内存活并整合入神经环路以改善运动功能 (A) 术后16周，V3组和OC0.33+V3组中STEM121（红色）与NeuN（绿色）免疫荧光染色的代表性图像。比例尺：500 μm（全景），20 μm（局部放大）。(B) 损伤中心及头侧/尾侧邻近区域STEM121⁺阳性面积百分比的定量分析（n=3）。(C) 损伤中心及头侧/尾侧邻近区域NeuN⁺阳性面积百分比的定量分析（n=3）。(D) 术后16周，各组损伤周围区域NeuN（绿色）与SYP（红色）共染色的代表性免疫荧光图像。比例尺：50 μm。(E) 损伤周围区域SYP⁺阳性面积百分比的定量分析（n=3）。(F) 移植后16周，给予DCZ、SALB及溶剂前后，SCI大鼠后肢抓力的定量分析（n=6）。(G) 移植后16周，给予DCZ、SALB及溶剂前后，SCI大鼠在水平梯测试中后肢有效步态率的定量分析（n=5）。(H) 实验设计示意图。共表达Bi-DREADDs（hM3Dq和KORD）的人胚胎干细胞被分化为脊髓V3神经前体细胞，并在损伤后移植入横断脊髓。依次给予DCZ、SALB及溶剂后进行行为学测试。

五、联合治疗多维度重塑脊髓损伤微环境

免疫荧光染色从神经再生、髓鞘修复、炎症调控和血管生成四个层面，系统评估了联合治疗对损伤微环境的重塑效果。

神经再生与胶质瘢痕抑制（图6）：联合治疗组损伤部位Tuj-1⁺神经元信号显著增加（图6A-D），同时GFAP⁺星形胶质细胞在损伤边界明显减少且排列更疏松（图6E-F），表明联合治疗有效促进了内源性神经再生并抑制了胶质瘢痕形成。

轴突与髓鞘再生（图7）：联合治疗组损伤部位NF200⁺轴突纤维密度显著增加、形态连续且排列更有序（图7A-D），同时MBP⁺髓鞘信号围绕轴突大量出现（图7E-G），表明联合治疗有效促进了轴突再生和髓鞘修复，为神经信号的高效传导提供了结构基础。

炎症调控与血管生成（图8）：联合治疗组中，iNOS⁺（M1促炎型）小胶质细胞/巨噬细胞几乎不表达，而Arg1⁺（M2抗炎型）细胞大量增加（图8A-D），表明水凝胶与V3细胞协同将免疫细胞向修复表型极化。同时，CD31⁺血管结构密度显著提高，新生血管形态更成熟（图8E-F），改善了损伤部位的血液供应。

以上结果表明，OC0.33+V3联合治疗通过抑制胶质瘢痕、促进轴突髓鞘再生、诱导免疫细胞向M2抗炎表型极化、刺激血管新生等多重机制，系统性地重塑了不利于再生的损伤微环境，为神经功能恢复创造了有利条件。

图6：OC0.33+V3联合治疗促进脊髓损伤后轴突再生并减轻胶质瘢痕形成 (A) 术后16周，损伤部位轴突标志物Tuj-1（红色）和星形胶质细胞标志物GFAP（绿色）的代表性免疫荧光图像。(a-d1) 损伤周围区（头侧），(a-d2) 损伤中心，(a-d3) 损伤周围区（尾侧）。比例尺：500 μm（全景），50 μm（局部放大）。(B–D) (B) 头侧、(C) 损伤中心和(D) 尾侧区域Tuj-1阳性面积的定量分析（n=5）。(E, F) (E) 头侧和(F) 尾侧损伤周围区域GFAP阳性面积的定量分析（n=5）。

图7：联合治疗促进脊髓损伤后轴突再生与髓鞘修复 (A) 术后16周，损伤部位神经丝蛋白200（NF200，红色）和髓鞘碱性蛋白（MBP，绿色）的代表性免疫荧光图像。(a-d1) 损伤周围区（头侧），(a-d2) 损伤中心，(a-d3) 损伤周围区（尾侧）。比例尺：500 μm（全景），50 μm（局部放大）。(B–D) (B) 头侧、(C) 损伤中心和(D) 尾侧区域NF200阳性面积的定量分析（n=5）。(E–G) (E) 头侧、(F) 损伤中心和(G) 尾侧区域MBP阳性面积的定量分析（n=5）。

图8：OC水凝胶显著抑制脊髓损伤后炎症反应并促进血管生成 (A) 术后16周，各组损伤区域中IBA1（小胶质细胞/巨噬细胞）和iNOS（M1表型标志物）表达的代表性免疫荧光图像。比例尺：50 μm。(B) IBA1和Arg1（M2表型标志物）表达的代表性免疫荧光图像。比例尺：50 μm。(C) iNOS相对荧光强度的定量分析（n=5）。(D) Arg1相对荧光强度的定量分析（n=5）。(E) 术后16周，各组CD31的代表性免疫荧光图像。白色箭头指示新生血管。比例尺：100 μm。(F) 脊髓损伤部位CD31/DAPI面积的定量分析（n=5）。

六、联合治疗改善神经源性膀胱结构与功能

联合治疗组膀胱体积明显缩小，膀胱湿重、膀胱/体重比、膀胱直径和周长均显著降低（图9A-E）。H&E染色显示逼尿肌纤维排列有序、结构致密（图9F-G）。Masson染色显示胶原沉积显著减少，平滑肌/胶原面积比显著提高（图9H-I），表明联合治疗有效延缓甚至逆转了脊髓损伤后膀胱组织的病理性纤维化进程。

图9：联合治疗改善脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍与病理性重塑 (A) 术后16周，各组 harvested 膀胱的代表性大体图像。比例尺：1 cm。(B–E) 研究终点时(B) 膀胱重量、(C) 膀胱/体重比、(D) 直径和(E) 周长的定量评估（n=5）。(F) 膀胱壁H&E染色的代表性切片。比例尺：1 mm（全景）；200 μm（a1-a4）；100 μm（b1-b4）。(G) 基于H&E染色切片的膀胱壁厚度定量分析（n=5）。(H) 膀胱Masson三色染色的代表性图像。比例尺：200 μm。(I) 膀胱壁平滑肌/胶原面积比的定量分析（n=5）。

七、总结与展望

该研究提出的“材料驱动调控+细胞功能整合”的双引擎策略，通过水凝胶的物理支撑、免疫调节与V3神经元的网络重建功能相协同，为脊髓损伤修复提供了全新的范式。研究团队指出，未来将在免疫正常动物模型和更接近临床的损伤模型中进一步验证，并深入探究材料与细胞协同的分子机制，以推动该策略的临床转化。