Sci. Adv.丨PET影像精准示踪细胞外囊泡“从肝到肺”重定向，引导siRNA递送治疗黑色素瘤肺转移

纳米药物静脉给药后往往被肝脏“截留”，如何实现肝外靶向递送一直是领域内的重要挑战。针对脂质体（LNP）的肝外递送近年来取得了一系列进展，但是针对生物来源的细胞外囊泡（EVs）的工程化改造仍在探索当中。

近日，华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科江大卫、安锐、兰晓莉团队联合中国医学科学院放射医学研究所刘鉴峰团队在 Science Advances上发表研究成果Helper lipid-engineered extracellular vesicles enable PET imaging-guided pulmonary siRNA delivery to treat lung metastasis，利用阳离子脂质DOTAP对肿瘤来源的细胞外囊泡（TMVs）进行工程化改造，成功将其体内分布从“肝截流”重定向为“肺趋向”。借助PET/CT和荧光多模态成像，研究团队在活体水平精准示踪了囊泡的命运转变，并揭示了其背后的蛋白冠介导机制：DOTAP修饰改变囊泡表面电荷，主动富集玻连蛋白、纤维蛋白原等肺靶向相关蛋白，从而介导肺部特异性蓄积。基于这一平台，装载siPD-L1的工程化囊泡在黑色素瘤肺转移模型中实现了高效的基因沉默和显著的免疫治疗效果。该研究为突破EVs肝脏蓄积瓶颈、实现核酸药物的肝外精准递送提供了新范式，也为肺转移瘤的免疫治疗开辟了新路径。

本研究利用阳离子脂质DOTAP对细胞外囊泡（EVs）进行工程化改造，从B16F10肿瘤细胞培养上清中分离出中等大小囊泡（TMVs）作为代表性EVs亚群，成功将EVs的体内分布从“肝截流”重定向至“肺趋向”，并借助PET/CT、荧光等多模态显像对其体内行为进行了精准活体示踪。研究团队进一步揭示了其背后的内源性“蛋白冠”介导机制，并基于此构建了装载治疗基因siPD-L1的囊泡递送系统TMVs-DOTAP/siPD-L1，在黑色素瘤肺转移模型中实现了精准的基因沉默与显著的治疗效果。

研究从B16F10肿瘤细胞培养上清中分离出TMVs，通过DOTAP修饰构建TMVs-DOTAP（图1A）。表征结果显示，DOTAP修饰使TMVs的Zeta电位从-9.34 mV显著提升至-0.46 mV（接近电中性），水合粒径略有增大（图1B-D）。但囊泡形态完整、标志蛋白TSG101和CD81表达正常。

图1肺靶向工程化囊泡TMVs-DOTAP的构建与表征。（A）TMVs分离、TMVs-DOTAP合成及多模态成像体内示踪的流程示意图。（B）透射电子显微镜（TEM）图像显示TMVs和TMVs-DOTAP均具有典型的囊泡形态；动态光散射（DLS）测定结果。（C）DLS测定显示，DOTAP修饰将TMVs的表面Zeta电位从-9.34 mV显著提升至-0.46 mV（接近电中性）。（D）TMVs与TMVs-DOTAP的多分散指数（PDI）均低于0.3，表明二者具有良好的粒径均一性。

研究团队采用Ga-68标记，通过PET/CT显像进行活体示踪。结果显示，未修饰的TMVs主要富集于肝脏（符合大多数纳米颗粒的典型分布模式），而TMVs-DOTAP则在肺部呈现选择性高效蓄积。注射后0.5 h肺摄取达10.45 ± 0.32 %ID/g，较TMVs提高8.65倍；注射后1 h，TMVs-DOTAP组肝脏摄取较TMVs组降低84.25%。肺/肝摄取比值的显著升高直观证实了TMVs-DOTAP实现了从“肝趋向”到“肺趋向”的体内分布重定向。

采用DiR近红外荧光标记进行长时程动态监测，结果显示DiR-TMVs-DOTAP在注射后快速蓄积于肺部，荧光信号可持续长达72 h以上；而DiR-TMVs则始终富集于肝脏。半定量分析表明，TMVs-DOTAP在肺部的荧光强度于48 h达到峰值，而肝脏信号始终维持在较低水平，进一步从荧光成像角度验证了其肺部高效蓄积与长效滞留特性。借助PET/CT与荧光显像技术，实现了对工程化囊泡体内命运的精准示踪。PET/CT提供了高灵敏度、全身定量的生物分布数据，荧光成像则实现了长时程动态监测，两种模态优势互补，共同证实了TMVs-DOTAP的肺部靶向能力。

研究通过静电吸附策略构建了TMVs-DOTAP/siRNA复合物，包封率达79.45%。共聚焦显微镜显示，TMVs-DOTAP/Cy5.5-siNC与B16F10细胞共孵育8小时后，红色荧光信号广泛分布于细胞质中，而游离Cy5.5-siNC组未见细胞内荧光。流式细胞术进一步证实了其高效递送能力。此外，研究进一步评估了B16F10细胞对TMVs、TMVs-DOTAP及TMVs-DOTAP/siNC的时间依赖性摄取。更重要的是，装载靶向PD-L1的siRNA后，TMVs-DOTAP/siPD-L1处理组在蛋白水平实现了显著的PD-L1基因沉默，较对照组表达显著降低，证实了序列特异性的基因沉默效果。

在B16F10肺转移瘤模型中，荧光显像与组织病理学分析显示，TMVs-DOTAP不仅能实现肺组织的整体靶向，更能精准蓄积于转移灶内部，并与Ki67高表达的肿瘤增殖区域高度共定位，表明该平台具备“器官-细胞”双级靶向优势。治疗结果显示，TMVs-DOTAP/siPD-L1组肺转移瘤负荷显著低于各对照组（P < 0.01）。机制研究表明，该治疗显著增加了CD4+及CD8+ T细胞的浸润与功能活化，促进了CD4+ T细胞向Th1表型（IFN-γ+）极化，并显著提升了GZMB+ CD8+ T细胞的比例。肿瘤局部TNF-α、IL-12、IFN-γ及Granzyme B水

当纳米颗粒进入血液后，其表面会迅速吸附血浆蛋白形成蛋白冠。蛋白冠的组成由纳米颗粒的理化性质主动塑造，反过来又决定了其与不同器官细胞的相互作用，主导体内分布与靶向性。因此，解析蛋白冠是理解纳米颗粒体内命运的关键。

为阐明肺靶向的分子机制，研究通过定量蛋白质组学分析了TMVs与TMVs-DOTAP/siNC表面的蛋白冠组成。结果显示，与TMVs组相比，TMVs-DOTAP/siNC组共有617种蛋白显著上调、1165种蛋白显著下调。TMVs-DOTAP/siNC组显著富集了玻连蛋白、纤维蛋白原、载脂蛋白A-I及凝血酶原等肺靶向相关蛋白。理化属性分析表明，丰度前20的蛋白中，TMVs-DOTAP/siNC组在生理pH下以负电荷蛋白为主，与DOTAP修饰引入的阳离子表面性质相符。这一发现从分子层面揭示了DOTAP修饰通过主动招募特定血浆蛋白形成功能性蛋白冠，进而介导肺靶向重定向的内源性机制。

目前，EVs领域的蛋白冠研究仍十分有限，现有工作主要集中于EVs自身携带的蛋白质，而对外源吸附蛋白冠如何影响EVs体内命运的关注不足。本研究首次系统比较了肝靶向与肺靶向EVs表面蛋白冠的组成差异，鉴定出肺靶向关键蛋白，证实了表面电荷修饰与蛋白冠组成之间的内在关联，为基于内源性靶向策略的EVs设计提供了关键实验数据。

本研究通过“载体构建-靶向验证-治疗应用-机制解析”的递进式探索，成功建立了一种基于工程化EVs的肺转移瘤精准免疫治疗新策略，突破了EVs肝脏蓄积瓶颈，为肝外器官靶向递送提供了新范式与实验依据。未来需进一步探讨该平台在更多肺部疾病模型中的普适性、正常组织PD-L1沉默的潜在风险、规模化生产的工程化挑战以及长期生物安全性评估。此外，在非人灵长类动物模型中验证其安全性与药代动力学特征，将为其临床转化奠定更坚实的基础。

华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科郭容、杨绍文博士为本文共同第一作者。华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科江大卫教授、安锐教授、兰晓莉教授及中国医学科学院放射医学研究所刘鉴峰教授为共同通讯作者。

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aec1692

制版人： 十一

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