APSB I 光驭囊泡，针达心肌：绿光重编程细胞外囊泡开启心梗修复新策略 (蔡本志/杨宝峰/潘振伟哈尔滨医科大学)

2026年3月3日，哈尔滨医科大学蔡本志、杨宝峰、潘振伟团队在药学领域权威期刊Acta Pharmaceutica Sinica B（中科院1区，IF=14.6）在线发表题为 “Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism” 的研究论文。该研究聚焦心肌梗死后心肌修复过程中干细胞来源细胞外囊泡产量低、活性不足及局部滞留差等临床转化瓶颈，围绕绿光光生物调节如何重编程人胚胎干细胞来源细胞外囊泡，并通过可降解水凝胶微针贴片实现梗死心肌精准、持续递送展开系统研究。研究发现，绿光重编程后的细胞外囊泡富集miR-423-3p，可通过调控ZBTB7A/PKM2轴增强心肌细胞糖酵解代谢，促进心肌细胞增殖和血管新生，同时抑制心肌细胞凋亡，最终显著改善心肌梗死后的心脏功能。该研究将光生物调节、细胞外囊泡工程和可降解微针递送平台有机结合，为缺血性心脏病的精准修复和再生治疗提供了全新策略。

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【摘要】

干细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）在心肌梗死（MI）的治疗中具有巨大的潜力。然而，高效生产具有高生物活性的EVs仍然是限制其临床转化的关键瓶颈。在此，我们证明了在绿光条件下进行的光生物调节（PBM）能够激活人类胚胎干细胞（hESCs），使其分泌更多具有卓越心肌保护活性的EVs。这些经PBM重编程的hESC-EVs通过促进心肌细胞增殖和血管生成，同时抑制细胞凋亡，改善了小鼠MI模型的心脏恢复情况。值得注意的是，我们验证了这些EVs同样能增强人类心肌细胞的存活和增殖，突显了其临床转化潜力。进一步的分析揭示，这种益处归因于重编程的hESC-EVs中含有较高的miR-423-3p，该物质通过调节ZBTB7A/PKM2轴增强糖酵解代谢并恢复线粒体功能。此外，我们合成了一种具有优越生物相容性、生物可降解性和机械强度的甲基丙烯酰水凝胶微针贴片，用于负载hESC-EVs，并通过改进的递送装置将该贴片输送至梗死心脏。该系统确保了EVs向缺血心肌的精准和持续递送，为MI提供了一种强有力的治疗方法。总而言之，这种基于光学和生物材料的方法有效制备了具有更高心肌保护活性的EVs，为心脏疾病提供了新的治疗策略。

(图文摘要说明：绿光重编程的人类胚胎干细胞来源的细胞外囊泡（hESC-EVs），被封装在三维GelMA微针中并通过真空辅助递送，通过miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2轴增强糖酵解，从而促进心脏修复。)

01

研究背景及科学问题

心肌梗死（MI）是全球发病率和死亡率的首要原因，对患者的健康和生活质量构成严重威胁。在MI的病理过程中，由于持续的缺血和缺氧损伤，大量功能性心肌细胞（CMs）发生坏死和凋亡。缺失的CMs随后被纤维瘢痕组织替代，导致心室重塑、心脏功能下降，并最终引发心力衰竭。尽管在外科、介入和药理学治疗方面取得了显著进展，但这些方法仍无法弥补MI后心肌细胞的丢失。几十年来，基于干细胞的再生医学为MI治疗带来了曙光。移植的干细胞通过肌力偶联和旁分泌作用，促进心肌收缩和血管生成，从而改善心脏功能。胚胎干细胞（ESCs）是一种来源于人类囊胚内细胞团的多能细胞，已被探索用于多种疾病的细胞治疗，包括年龄相关性黄斑变性、脊髓损伤和1型糖尿病。值得注意的是，ESCs由于其自我更新和分化能力，在心脏修复方面也具有巨大前景。然而，它们的临床应用受到一些挑战的限制，包括免疫排斥和致瘤性的显著风险、不理想的生物分布与定植，以及伦理问题。

细胞外囊泡（EVs）是带有脂质双分子层的微小膜泡，携带着蛋白质、mRNA、非编码RNA和脂质，是细胞间信息传递和物质交换的重要介质。源自干细胞的EVs已显示出可观的治疗特性，且安全性问题较少，具有“现成可用”的便利性。最近的一项研究表明，由胚胎干细胞分泌的EVs（ESC-EVs）能有效改善衰老小鼠的年龄相关病理表型并挽救其转录组谱。此外，ESC-EVs还被证明具有一定的抗肿瘤特性。在Khan等人的研究中，发现小鼠ESC-EVs能增强新生血管形成和CM存活，同时减少纤维化，从而改善MI后的心脏功能。因此，基于EV的“无细胞”治疗策略凭借其优越的生物相容性，可能成为临床治疗中ESCs的理想替代品。尽管如此，用于心脏修复的EV治疗通常受到产量低、半衰期短和组织滞留性差等几项挑战的制约。为了达到治疗效果，需要反复给药，而多剂量的EV心内注射属于高侵入性且耗时的手术。因此，许多研究开始致力于通过各种条件提升干细胞衍生EVs的治疗效果。

光生物调节（PBM）是一种非侵入性疗法，利用特定波长内低强度、生物相容的光线穿透组织并与细胞内的发色团相互作用。这种相互作用触发一系列光物理和光化学事件，最终调节各种细胞和组织的命运。研究表明，PBM可以诱导多种积极的生物反应，包括增强细胞增殖、促进代谢过程和减轻炎症反应。因此，这项技术已被广泛应用于临床以促进伤口愈合、缓解疼痛以及促进肌肉和神经组织的再生。值得注意的是，通过激光或发光二极管（LEDs）实施的PBM，也被认为是一种能够有效调节干细胞生物学特征和功能的有力工具，且独立于基因或药物干预。然而，目前的研究主要集中在PBM对干细胞的直接细胞内作用。PBM是否会影响ESCs的分泌功能，从而改变其衍生EVs的组成和生物学功能，仍有待探索。此外，除了调节EVs的生物活性外，应用先进的递送系统来增强EVs在损伤部位的滞留并实现持续释放同样至关重要。近年来，微针（MN）贴片已成为再生医学中一种有前景的长期局部药物递送平台。它们提供了微创的进入方式、对药物释放的时空控制以及改善的局部滞留性，已成功应用于糖尿病和慢性难治性伤口的修复。受这些进展的鼓舞，我们认为将这种功能平台应用于心脏递送可以克服直接注射EV进行心肌修复的局限性。

在本研究中，我们开发了一种用PBM处理人类胚胎干细胞（hESCs）并随后分离其释放的EVs的方案。我们的结果表明，波长为520 nm的光（绿光）进行PBM能够刺激hESCs产生具有增强生物活性的EVs。这些EVs通过调节糖酵解代谢和线粒体稳态，促进了心肌细胞周期重新进入、抑制心肌细胞凋亡并促进血管生成，从而显著恢复了MI后的心脏功能。此外，为了解决局部心肌内注射EVs后组织滞留率低的问题，我们制备了一种具有优异生物相容性、生物可降解性和机械强度的甲基丙烯酰明胶（GelMA）微针贴片，用于负载hESC-EVs，然后通过一种改良装置将贴片附着在梗死心脏上。GelMA微针贴片通过实现hESC-EVs的靶向和持续释放，增强了其对MI的治疗功效。总而言之，我们的发现证明，这种基于光学和生物材料的方法可以有效制备具有更高心肌保护活性的EVs，用于治疗缺血性心脏病。

02

重要发现及亮点

3.1 绿光介导的光生物调节增强了hESC-EVs的心肌保护活性

首先，我们通过超速离心从未经处理的H9-hESCs条件培养基中分离出hESC-EVs。透射电子显微镜（TEM）观察显示，hESC-EVs呈现典型的杯状囊泡结构。同时，纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示其粒径呈单峰钟形分布，集中在100 nm左右，证实了hESC-EVs的成功纯化。为了确定hESC-EVs对CMs的最佳干预剂量，我们使用CCK-8检测评估了用不同浓度的hESC-EVs处理后CM的存活率。结果显示hESC-EVs以剂量依赖的方式增强CM活力，在终浓度为$3\times10^9$ particles/mL时观察到最显著的作用，这被选为我们后续研究的浓度。随后，为了评估PBM是否影响hESC-EVs的生物活性，我们将hESCs暴露在多种波长的光下，包括绿光（520 nm）、红光（630 nm）、黄光（590 nm）和蓝光（470 nm）。然后收集每个照射组的等量EVs用于处理CMs 48小时。结果显示，与无光和其它波长光处理的组相比，在$2.5 mW/cm^2$的功率密度下暴露于绿光的hESCs所衍生的EVs显著提高了CM的活力。为进一步确定最佳照射持续时间，我们评估了在不同持续时间的绿光照射下hESC-EVs的生物活性。CCK-8检测显示，与其它组的等量EVs相比，暴露于绿光30分钟的hESCs衍生的EVs显著提高了CM的活力。随后的NTA显示，EV的产量也在30分钟时达到峰值。因此，选择30分钟的绿光照射（520 nm，$2.5 mW/cm^2$）来刺激我们后续实验中的hESCs，这些经PBM重编程的hESC-EVs被命名为PbEE。

我们进一步表征了PbEE的形态。TEM和NTA均显示PbEE展示出与对照hESC-EVs（CEE）相当的形态特征和粒径分布。蛋白质印迹（Western blot）分析显示，来自相同数量H9-hESCs的PbEE中EV标志物（Flotillin-1、TSG101、CD63）的水平高于CEE。在H1-hESCs中得到了高度一致的结果，进一步证实了绿光照射增强了hESCs的EV产量。为确定PbEE和CEE对CMs的生物活性，我们使用膜特异性荧光探针（EV-Tracker）标记这些EVs。孵育12小时后，在心肌细胞骨架中检测到了EVs的红色荧光信号。同样，在CMs中也观察到了来自GFP-CD63标记的EVs的绿色荧光，表明EVs被成功内化。随后，用等量颗粒数的CEE或PbEE分别处理CMs 48小时。与CEE相比，PbEE显著增加了CMs中增殖标志物EdU、Ki67和pH3的阳性率。此外，在缺氧条件下，与CEE相比，PbEE进一步减少了TUNEL阳性CMs的数量。在源自H1-hESCs的PbEE中进一步验证了一致的结果。这些发现表明，在促进细胞周期激活和抑制CM凋亡方面，PbEE相比等量CEE具有更优越的生物活性。

图1 绿光诱导人胚胎干细胞（hESCs）分泌具有增强心脏保护活性的细胞外囊泡（EVs）。

（A）光生物调节重编程hESC来源EVs（PbEE）的制备与提取流程。使用BioRender.com绘制。（B）PbEE和对照hESC来源EVs（CEE）的代表性透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺：200 nm。（C）PbEE和CEE的纳米颗粒追踪分析（NTA）结果。（D，E）来源于等量H9-hESCs的EVs中Flotillin-1、TSG101和CD63的Western blot分析（n=4–5）。（F）EV-tracker标记的EVs（红色）与新生小鼠心肌细胞共培养12 h后的内吞情况。绿色：Alpha Actinin；蓝色：DAPI。比例尺：10 μm。（G–J）采用EdU、Ki67和pH3染色（红色）评估等剂量CEE和PbEE处理后心肌细胞增殖的代表性图像及定量分析（3×10⁹ particles/mL；n=6）。白色箭头：阳性细胞。比例尺：主图20 μm，放大图10 μm。（K，L）TUNEL染色（红色）检测心肌细胞凋亡的代表性图像及定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.2 PbEE在体外表现出比CEE更强的促血管生成活性

鉴于血管生成在MI后心脏修复中的关键作用，我们进一步比较了PbEE和CEE对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的促血管生成作用。在与Tracker探针标记的EVs孵育6小时后，在HUVECs内观察到明显的红色荧光信号，表明EV的内吞作用。然后，将HUVECs接种在涂有Matrigel的板上，并用等量的CEE和PbEE颗粒进行处理。值得注意的是，相比CEE处理，PbEE处理的HUVECs能够形成更多的管状网络。一致地，伤口愈合试验表明，CEE和PbEE均增强了HUVECs的迁移，而PbEE显示出更优异的功效。这些发现表明，PbEE在体外比CEE具有更强的促血管生成潜力。

图2 在心肌梗死（MI）小鼠中，PbEE较CEE表现出更强的心脏保护作用。
（A）体内实验流程示意图。使用BioRender.com绘制。ECHO：超声心动图。（B，C）MI后第28天的代表性超声心动图（B）及左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）的定量分析（C）。小鼠接受等剂量CEE或PbEE处理（3×10¹⁰ particles；n=10）。（D，E）MI后第28天Masson三色染色代表性图像及梗死面积定量分析（n=10）。比例尺：500 μm。（F，G）MI后第14天梗死边缘区采用Ki67、pH3和Aurora B染色（红色）评估心肌细胞增殖的代表性图像及定量分析（n=6）。绿色：Alpha Actinin；蓝色：DAPI。白色箭头：阳性心肌细胞；方框区域：放大图。比例尺：主图20 μm，放大图10 μm。（H）MI后第14天心肌细胞核型模式的代表性图像及定量分析，包括单核心、双核心和多核心心肌细胞比例（n=6）。比例尺：20 μm。（I）MI后第7天梗死边缘区TUNEL阳性心肌细胞（红色）的代表性图像及定量分析（n=6）。方框区域：放大图。比例尺：主图20 μm，放大图10 μm。（J）MI后第28天梗死边缘区CD31阳性毛细血管（绿色）的免疫荧光染色及定量分析（n=6）。蓝色：DAPI。比例尺：20 μm。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.3 PbEE对MI小鼠发挥更强的治疗作用

为了评估CEE和PbEE在成年MI小鼠中的治疗潜力，我们在诱导MI后通过心肌内注射给予了不同剂量的这些EVs（每只动物注射30 µL生理盐水，含$1\times10^9$、$3\times10^{10}$和$9\times10^{11}$个颗粒）。在第28天对心脏功能的评估显示，$3\times10^{10}$个颗粒在CEE和PbEE组中诱发了最显著的功能改善，且PbEE在所有剂量下均表现出比CEE更优的疗效。基于此，$3\times10^{10}$颗粒/只被选定为进一步实验的最佳浓度。组织学分析进一步表明，与CEE相比，PbEE治疗导致梗死面积显著减小。此外，PbEE治疗减轻了MI诱导的心脏/体重比增加和CM横截面积增大，表明PbEE对MI后的不良重塑具有更强的保护作用。

此外，免疫荧光染色显示，与等量颗粒数的CEE相比，PbEE治疗显著增加了梗死心脏边缘区Ki67、pH3和Aurora B阳性CMs的数量。PbEE也显著提高了成人CMs的总数以及单核CMs的比例。在CEE或PbEE治疗后，没有观察到对远端区域的CM增殖有显著影响。与体外在NMCMs中获得的结果一致，PbEE治疗显著减少了边缘区的凋亡CMs（相对于CEE）。此外，虽然CEE和PbEE都增强了血管生成，但PbEE表现出比等量CEE更大的促血管生成效果。综合而言，这些结果表明PbEE通过促进CM增殖、抑制CM凋亡并刺激血管生成，在对抗缺血损伤方面具有更强的心肌保护作用。

图3 miR-423-3p介导PbEE的心脏保护作用。
（A）Pandora测序流程示意图。使用BioRender.com绘制。（B，C）PbEE和CEE之间差异表达小非编码RNA（sncRNAs）的热图和火山图。红色：上调；蓝色：下调（n=3）。（D）采用qRT-PCR检测PbEE和CEE中sncRNAs的表达（n=4）。（E，F）采用EdU、Ki67和pH3染色评估心肌细胞增殖的代表性图像及定量分析（n=6）。绿色：Alpha Actinin；蓝色：DAPI。白色箭头：阳性心肌细胞。比例尺：20 μm。（G，H）antagomir-miR-423-3p转染48 h后，人胚胎干细胞（hESCs）及其来源细胞外囊泡（hESC-EVs）中miR-423-3p水平（n=6）。（I，J）低氧24 h条件下，经PbEE、PbEE-NC或PbEE-antago-miR-423-3p（PbEE-anta）处理后心肌细胞凋亡的代表性图像及凋亡指数（n=6）。比例尺：50 μm。（K–N）低氧心肌细胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax的Western blot分析（n=5）。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示无显著差异。

3.4 PbEE通过miR-423-3p发挥心肌保护作用

众所周知，EVs中丰富的小非编码RNA（sncRNAs）在介导细胞内活动和细胞间通讯中起着关键作用。为了进一步探索PbEE发挥治疗作用的分子机制，我们通过PANDORA-seq分析了同等颗粒数的CEE和PbEE之间包括miRNA、piRNA、tsRNA、rsRNA和snoRNA在内的sncRNA表达谱差异。结果显示，与CEE相比，PbEE组中有11种sncRNAs显著增加，7种sncRNAs显著减少（P<0.05）。在这些上调的sncRNAs中，根据倍数变化值≥2筛选出4种高度差异表达的sncRNAs（hsa-miR-423-3p、hsa-let-7b-5p、piR-hsa-440814和hsa-miR-30d-5p）。为了验证测序结果，我们进一步使用qRT-PCR检测了这4种sncRNAs在两组EVs中的表达。结果显示，PbEE中miR-423-3p的表达显著高于CEE。此外，我们还检测了hESCs中miR-423-3p的表达，结果表明与未处理的hESCs相比，暴露于绿光的hESCs中miR-423-3p的水平显著升高。因此，绿光照射能够上调hESCs及其衍生EVs中miR-423-3p的表达。

随后，我们检测了在等量CEE和PbEE颗粒处理下的CMs中miR-423-3p的表达。结果显示，与CEE组相比，PbEE处理显著上调了CMs中miR-423-3p的表达。此前的研究表明，在多个物种中高度保守的miR-423-3p介导肝细胞癌和胃癌中的细胞生长。然而，miR-423-3p是否参与MI后CM增殖和心脏再生尚不清楚。为了进一步确定miR-423-3p在PbEE介导的心脏保护中的潜在作用，我们在绿光暴露后使用antagomir（拮抗剂）抑制hESCs中miR-423-3p的表达。qRT-PCR检测证实了miR-423-3p在hESCs及其衍生EVs中均被有效敲减。随后的免疫荧光显示，与PbEE-NC组相比，PbEE-antagomir-miR-423-3p（PbEE-anta）组中EdU、pH3和ki67阳性的CMs显著减少。这表明敲除miR-423-3p减弱了PbEE诱导的CM增殖。此外，抑制miR-423-3p显著削弱了PbEE的抗凋亡作用，这反映在PbEE-anta组中TUNEL阳性CMs增加，cleaved-Caspase 3和Bax表达升高，而Bcl2水平降低。这些结果共同证明，miR-423-3p是PbEE促进CM增殖和抗凋亡的关键分子。

图4 miR-423-3p通过靶向ZBTB7A/PKM2轴促进心肌细胞增殖。
（A）基于TargetScan和TarBase对miR-423-3p靶基因进行生物信息学预测。（B，C）心肌细胞经PbEE处理或未处理48 h后的糖酵解压力测试曲线及细胞外酸化率（ECAR）定量分析（n=4）。（D）人和小鼠ZBTB7A mRNA 3′UTR中保守miR-423-3p结合位点的序列比对，以及野生型（WT）和突变型（Mut）荧光素酶报告载体构建示意图。（E）HEK293T细胞共转染miR-423-3p mimics与ZBTB7A-WT或ZBTB7A-Mut载体后的荧光素酶报告实验（n=3）。（F，G）心肌细胞中ZBTB7A蛋白水平的Western blot分析及定量（n=4）。（H–K）EdU、Ki67和pH3阳性心肌细胞的代表性免疫荧光图像及定量分析（n=6）。绿色：Alpha Actinin；蓝色：DAPI。白色箭头：增殖心肌细胞。比例尺：20 μm。（L，M）采用qRT-PCR和Western blot检测PKM2在mRNA和蛋白水平的表达（n=6）。（N，O）调控miR-423-3p和ZBTB7A水平后，采用Seahorse分析心肌细胞糖酵解水平（n=3–4）。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示无显著差异。

3.5 绿光通过TRP-Ca2+-CAMKII-CREB信号轴上调hESCs和EVs中的miR-423-3p

此前的研究表明，绿光PBM可以通过瞬时受体电位（TRP）通道诱导钙内流，从而激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CAMKII）及其下游转录因子cAMP响应元件结合蛋白（CREB），进而调节靶基因的转录。为了探讨绿光诱导hESCs及其EVs中miR-423-3p上调的上游机制，我们首先评估了其对细胞内钙动员的影响。Fluo-4 AM荧光检测表明，绿光照射显著升高了hESCs内的钙水平，而TRP通道抑制剂SKF消除了这种诱导作用。Western blot分析进一步揭示，绿光增强了CAMKII和CREB的磷酸化，这也因TRP通道抑制而受阻。接下来，我们通过qRT-PCR量化了miR-423-3p的表达。绿光暴露显著提高了hESCs中pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p的水平，并相应增加了EVs中的成熟miR-423-3p。当TRP通道被抑制时，这些作用被逆转，表明TRP-Ca2+通路对绿光诱导的miR-423-3p上调是必不可少的。

为了确定CREB是否直接调节miR-423-3p转录，我们对miR-423启动子进行了荧光素酶报告基因检测。CREB过表达显著增强了荧光素酶活性，提示存在直接结合和转录激活。此外，hESCs中CREB敲减导致pri-miR-423-3p和成熟miR-423-3p显著减少，证实了其调节作用。总的来说，这些发现表明，绿光激活TRP-Ca2+-CAMKII-CREB轴以促进hESCs中miR-423-3p转录，从而增加EVs中miR-423-3p的丰度。

图5 miR-423-3p通过上调PKM2抑制心肌细胞凋亡。
（A，B）在有或无miR-423-3p过表达条件下，低氧24 h后心肌细胞TUNEL染色代表性图像及凋亡心肌细胞定量分析（n=6）。比例尺：50 μm。（C，D）miR-423-3p过表达后，低氧心肌细胞中cleaved-Caspase 3、Bcl2和Bax蛋白水平的Western blot分析（n=4–5）。（E）心肌细胞共转染agomir-miR-423-3p与ZBTB7A过表达载体或PKM2 siRNA后的JC-1荧光代表性图像。红色：聚合体；绿色：单体。比例尺：25 μm。（F）JC-1聚合体/单体荧光强度比值的定量分析（n=6）。（G，H）心肌细胞内活性氧（ROS，绿色）的代表性图像及定量分析（n=6）。比例尺：25 μm。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.6 MiR-423-3p通过靶向ZBTB7A/PKM2轴调节心肌细胞周期激活、心肌细胞凋亡和血管生成

为了进一步研究miR-423-3p促进CM细胞周期激活的分子机制，我们使用TargetScan和TarBase算法进行生物信息学分析，以识别具有miR-423-3p保守结合位点的靶基因。在匹配两个数据库中的推断靶标后，我们发现Zbtb7a、Rap2c、Pabpc1和Kctd2被两种方法共同筛选出来。目前公认，促进代谢向糖酵解的转化可以逆转CM细胞周期停滞。在我们的研究中，通过海马糖酵解压力测试（Seahorse assay）评估，发现PbEE处理后CM糖酵解能力显著增强。已有研究表明，ZBTB7A（POZ/BTB和POK转录因子家族成员）直接结合并抑制关键糖酵解基因（包括丙酮酸激酶M2，Pkm2）的转录，从而调节肿瘤进展。然而，ZBTB7A是否能介导CMs中的糖酵解代谢和MI后的心脏修复尚不清楚。因此，我们推测PbEE中的miR-423-3p可能通过下调ZBTB7A表达来促进CM糖酵解代谢，从而使CM能够重新进入细胞周期。

为了证实这一假设，我们首先分别构建了携带ZBTB7A mRNA 3'UTR结合位点或突变位点的荧光素酶报告载体。当与miR-423-3p共转染时，野生型ZBTB7A mRNA 3'UTR的荧光素酶活性被抑制，而当3'UTR结合序列突变时则没有出现活性的降低，这表明miR-423-3p可以直接靶向ZBTB7A的3'UTR。然后，为了验证miR-423-3p与ZBTB7A之间的关系，我们调节了CMs中miR-423-3p的表达，发现过表达miR-423-3p降低了ZBTB7A蛋白水平，而抑制miR-423-3p则增加了ZBTB7A蛋白的表达。这些结果证明miR-423-3p在CMs中直接靶向并负向调节ZBTB7A的表达。此外，我们检验了ZBTB7A是否能调节miR-423-3p在CM增殖中的调控作用。免疫荧光染色显示，ZBTB7A的过表达抑制了由miR-423-3p诱导的EdU、Ki67和pH3阳性CM的增加。

随后，我们进一步研究了miR-423-3p是否通过ZBTB7A影响PKM2表达，从而促进CMs中的糖酵解。结果显示，过表达miR-423-3p显著上调了PKM2的mRNA和蛋白质表达，但ZBTB7A的强制表达逆转了miR-423-3p的促进作用。同时，我们进行了海马糖酵解压力测试来评估miR-423-3p和ZBTB7A在CM代谢中的作用。结果显示，强制表达miR-423-3p增强了CMs的糖酵解能力，而同时过表达ZBTB7A则逆转了miR-423-3p的糖酵解促进作用。总的来说，这些发现表明miR-423-3p抑制ZBTB7A表达，从而促进Pkm2转录，由此提升CMs中的糖酵解代谢并最终解除CM细胞周期的阻滞。

此外，我们发现，如TUNEL阳性CMs减少、cleaved-Caspase 3和Bax水平降低以及Bcl2表达上调所示，过表达CMs中的miR-423-3p显著抑制了缺氧诱导的CM凋亡。众所周知，PKM2不仅是需氧糖酵解的促进剂，也是线粒体稳态和细胞存活的调节剂。在本研究中，JC-1检测显示，由缺氧引起的CM线粒体膜电位下降由于miR-423-3p的过表达而得到显著的保持。然而，miR-423-3p对线粒体膜电位的稳定作用却被过表达ZBTB7A或敲低PKM2所抑制。此外，线粒体活性氧（ROS）的产生在ago-miR-423-3p组中显著减少，而在CM中过表达ZBTB7A或敲低PKM2则能逆转这一现象。此外，与CEE组相比，在PbEE处理的HUVECs中，我们也发现miR-423-3p和PKM2的表达显著增加，同时ZBTB7A的水平有所降低。总的来说，这些结果表明miR-423-3p通过靶向PKM2维持CM线粒体功能、抑制细胞凋亡并促进血管生成。

为了进一步验证miR-423-3p在MI后心脏修复中的作用，我们在小鼠MI模型中通过尾静脉注射给予了agomir-miR-423-3p。接受agomir-miR-423-3p的小鼠表现出显著改善的心脏功能和缩小的梗死面积。此外，agomir-miR-423-3p组的Ki67和pH3阳性CM数量明显增加。agomir-miR-423-3p组的TUNEL阳性CM数量也相应减少。qRT-PCR分析证实，全身注射agomir导致心脏组织中miR-423-3p显著过表达。另外，过表达miR-423-3p下调了ZBTB7A的表达，同时上调了心脏组织和成人CM中PKM2的表达。上述发现表明，过表达miR-423-3p可通过促进CM存活显著改善MI后的心脏功能。

图6 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）微针（MN）贴片的制备与表征。
（A）GelMA微针制备流程示意图。（B）完整微针贴片的宏观数字图像（左）及单个微针的放大图（右）。比例尺：左图1 mm，右图200 μm。（C）不同放大倍数下显示微针形貌的代表性扫描电子显微镜（SEM）图像。（D）压缩测试中微针贴片的力学性能表征（应力-应变曲线）。比例尺：200 μm。（E，F）装载Tracker探针标记PbEE（红色）的微针贴片的光学和荧光显微镜图像。（G）采用纳米颗粒追踪分析（NTA）定量检测PbEE从微针贴片中随时间释放的累积释放曲线（n=3）。（H）微针贴片与低氧心肌细胞共培养体系示意图。使用BioRender.com绘制。（I，J）低氧3天并分别与单独MN、游离PbEE或PbEE装载微针（PbEE@MN）共孵育后，心肌细胞TUNEL染色代表性图像及凋亡心肌细胞定量分析（n=6）。蓝色：DAPI。比例尺：50 μm。（K–M）处理7天后Ki67和pH3阳性心肌细胞的代表性免疫荧光图像及定量分析（n=6）。白色箭头：阳性增殖信号。比例尺：20 μm。数据以均值±SEM表示。**P<0.01，***P<0.001。

3.7 ZBTB7A的过表达消除了PbEE在体内的心肌保护作用

为了进一步探究ZBTB7A在PbEE心肌保护作用中的角色，我们使用重组AAV9系统在接受PbEE治疗的MI小鼠中诱导了心脏特异性的ZBTB7A过表达。不出所料，过表达ZBTB7A（MI+PbEE+AAV9-ZBTB7A）极大地抵消了PbEE对心脏收缩力的治疗益处（如EF%和FS%相对于MI+PbEE+AAV9-NC组降低所证明的）。一致地，由PbEE诱导的梗死面积减小也被ZBTB7A的过表达所逆转。此外，心脏组织的免疫荧光染色显示，与MI+PbEE+AAV9-NC组相比，过表达ZBTB7A显著减少了Ki67阳性CM的数量，增加了TUNEL阳性CM的比例，并降低了CD31的信号强度。Western blot分析显示PbEE处理下调了ZBTB7A并上调了PKM2，而ZBTB7A的强制表达有效阻断了PbEE诱导的PKM2上调。这些结果表明，ZBTB7A的过表达消除了PbEE的心肌保护作用。

图7 PbEE@MN促进人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）增殖并抑制其凋亡。
（A）hESC-CM分化流程示意图。使用BioRender.com绘制。（B）PbEE@MN与hESC-CMs共培养实验设计示意图。（C，D）低氧3天后，经单独MN、CEE、PbEE或PbEE@MN处理的hESC-CMs中TUNEL染色代表性图像及凋亡细胞定量分析（n=6）。蓝色：DAPI。比例尺：20 μm。（E，F）共培养7天后Ki67⁺和pH3⁺ hESC-CMs的代表性免疫荧光图像及定量分析（n=6）。白色箭头：阳性增殖信号。比例尺：20 μm。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.8 负载PbEE的GelMA微针贴片的表征

尽管EVs具有治疗前景，但其快速清除和靶部位的滞留性差阻碍了其临床转化。为了实现PbEE向梗死心肌的局部持续递送，我们通过两步模板法制备了甲基丙烯酰明胶（GelMA）微针（MN）贴片。光学显微镜显示微针尖端呈圆锥形并排列成精确的阵列。该贴片由68根独立的针组成，均匀分布在直径为0.6 cm的圆形底板上。SEM显示每根针尖平坦且完整，长度约为650 µm，基部直径为320 µm。随后我们评估了决定MN穿透心肌能力的机械性能，结果显示单根针的机械强度为0.4 N，据报道这足以在不断裂的情况下穿透心肌。为了可视化EV在水凝胶基质中的分布，我们将荧光标记的PbEE掺入MN贴片中。光学和荧光显微镜图像都证实了EVs均匀分布在整个MN结构中。随后进行了体外释放研究以表征EVs的释放动力学。在多个时间点通过NTA对释放的EV颗粒的累积数量进行量化。释放曲线显示前三天内呈现初始突释，随后进入了较长时期的持续释放阶段。这些结果表明，MN贴片能够在延长的时间段内持续递送PbEE。

治疗用MN应用中一个关键的考量是其制造过程是否会损害EV的完整性和生物活性。为了解决这个问题，我们比较了从溶解的MN中回收的PbEE（MN-PbEE）与天然未经处理的PbEE（NA-PbEE）。Zeta电位分析显示MN-PbEE和NA-PbEE之间的表面电荷没有显著差异，这暗示其膜稳定性得以保持。TEM进一步证实MN-PbEE维持了其典型的杯状形态。为了评估囊泡内装载物的完整性，我们定量了PbEE中关键功能miRNA（miR-423-3p）的表达水平，结果未观察到MN-PbEE和NA-PbEE之间存在显著差异。然后我们在体外评估了MN-PbEE的细胞摄取和功能表现。摄取检测显示，MN-PbEE被CM内化的效率与NA-PbEE相当。在功能上，MN-PbEE能显著增强CM增殖并抑制凋亡，其程度与NA-PbEE相似。此外，两组EVs之间的促血管生成能力也没有显著差异。这些结果证明在MN制造后，PbEE的生物活性得到了保持。

接下来我们评估了与传统的直接孵育相比，MN介导的递送是否能进一步增强PbEE的治疗效能。我们通过直接孵育或MN介导递送用PbEE处理原代CMs 3-7天。后续分析显示，与直接PbEE孵育相比，负载在MNs中的PbEE（PbEE@MN）对CM凋亡表现出更显著的抑制作用。一致地，相对于直接的PbEE处理，PbEE@MN进一步增加了Ki67和pH3阳性CM的比例，表明对CM增殖的促进作用增强。为了进一步评估PbEE的临床转化潜力，我们将研究扩展至人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞（hESC-CMs）。与原代NMCMs一致，PbEE在hESC-CMs中表现出比CEE更强的抗凋亡和细胞周期激活活性。重要的是，PbEE@MN的治疗功效优于游离的PbEE。上述发现表明，封装在MN内的PbEE表现出良好的稳定性，并对CM凋亡和细胞周期激活发挥持续的有益作用。

图8 GelMA微针贴片延长PbEE滞留时间并增强其在MI中的治疗效果。
（A）体内研究设计示意图。使用BioRender.com绘制。（B）将PbEE装载微针贴片应用于MI心脏的宏观图像。图III和图IV分别表示贴附后5 min和10 min的状态。（C）植入后第3天微针贴片稳定附着于心脏表面。比例尺：1 mm。（D）H&E染色显示微针穿透心肌组织的代表性图像。比例尺：500 μm。（E）微针处理后第28天心脏宏观图像。比例尺：1 mm。（F）微针处理后第28天心脏Masson三色染色代表性图像。比例尺：500 μm。（G）采用H&E染色检测微针处理组心脏是否存在异常炎症浸润或结构改变。比例尺：50 μm。（H）采用qRT-PCR分析炎症因子Tnfa、Il1b和Il6的mRNA表达（n=3）。（I）MI后第0、3和14天采用生物发光成像（BLI）追踪心脏中EVs的分布（n=4）。（J）PbEE或PbEE@MN处理后第28天代表性M型超声心动图。（K）第28天梗死区域Masson三色染色代表性图像。比例尺：500 μm。（L，M）左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）的定量分析（n=10）。（N）梗死面积定量分析（n=10）。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns表示无显著差异。

3.9 PbEE@MN对MI小鼠的治疗作用

基于体外研究证实MNs可以有效加载和释放PbEE，我们进一步评估了PbEE@MN（负载了$3\times10^{10}$个PbEE颗粒）在成年小鼠MI模型中的治疗潜力。将MN贴片放置在连接到真空的泵头装置上，通过将该装置保持在梗死心脏上5秒，MN针尖完全插入心肌而没有脱落。H&E染色显示出MN针尖穿透心肌组织的针孔。为了评估MN贴片在体内的降解情况，我们在植入后第3、7和14天获取了心脏表面贴片的图像。图像显示结构完整性呈现时间依赖性降低，到第14天时贴片几乎检测不到。这一观察通过Masson三色染色得到进一步验证，证实了MN贴片具有可生物降解的性质。为了评估MNs的心脏安全性，将空MN穿透的心脏组织与正常心脏组织（Ctl）进行了比较。H&E染色显示MN处理的心脏没有异常的炎症浸润或结构改变。qRT-PCR进一步证实MN处理组和Ctl组之间炎症因子Tnfa、Il1b和Il6的表达没有显著差异，表明MNs具有良好的生物相容性。为了测定PbEE在小鼠心肌中的保留率，我们利用Tracker探针标记的EVs来观察心肌内注射PbEE和PbEE@MN处理后不同时间段心脏中的荧光信号。在第3天，PbEE@MN组的EV荧光强度显著高于PbEE组。在第14天，注射PbEE的心脏中信号不再存在，但在使用PbEE@MN处理的心脏中信号仍然明显。这些结果表明，制备的MN贴片能够持续有效地将PbEE递送至心肌缺血区域。

随后，我们评估了PbEE@MN对梗死心脏的治疗效果。结果表明，接受PbEE@MN治疗（负载了$3\times10^{10}$个PbEE颗粒）的动物表现出比接受PbEE心肌内注射的动物在心脏功能、心/体重比、梗死面积和CM横截面积方面更显著的改善。免疫荧光染色和体视学分析表明，与注射PbEE的组相比，PbEE@MN组的Ki67、pH3和Aurora B阳性CM数量、单核CM比例以及CM总数显著增加。此外，TUNEL分析显示，PbEE@MN发挥的抗凋亡作用比直接注射PbEE更强（体现为凋亡CM的显著减少）。同时，与注射PbEE组相比，PbEE@MN进一步促进了梗死心脏的血管生成。综上所述，这些数据表明，MN贴片确实通过长时间持续释放EVs提高了PbEE的治疗效果。

为了进一步确认miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2轴在PbEE@MN介导的心肌保护中的关键作用，我们检测了PbEE和PbEE@MN治疗后MI心脏中ZBTB7A和PKM2的表达。结果显示，PbEE@MN显著抑制了心脏组织中ZBTB7A的表达并上调了PKM2的蛋白水平。然后，将敲低miR-423-3p的PbEE加载到MNs中（PbEE-anta@MN）并评估其对心脏修复的影响。我们发现沉默miR-423-3p部分消除了PbEE@MN对心肌损伤的保护作用。这些发现表明miR-423-3p是PbEE@MN介导心肌保护的关键分子。

图9 通过微针贴片递送PbEE促进心脏恢复并表现出良好生物相容性。
（A）MI后第28天心脏重量/体重比（n=6）。（B）麦胚凝集素（WGA）染色（绿色）代表性图像及心肌细胞横截面积定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（C）分离心肌细胞的代表性图像及定量分析（n=6）。比例尺：100 μm。（D）MI后第14天心肌细胞核型模式的代表性图像及定量分析，包括单核心、双核心和多核心心肌细胞占总心肌细胞的比例（n=6）。比例尺：20 μm。（E）MI后第14天梗死边缘区Ki67⁺、pH3⁺和Aurora B⁺心肌细胞的代表性免疫荧光图像及定量分析（n=6）。白色箭头：阳性心肌细胞；方框区域：放大图。比例尺：主图20 μm，放大图10 μm。（F）MI后第7天梗死边缘区凋亡心肌细胞的TUNEL染色（红色）代表性图像及定量分析（n=6）。比例尺：主图20 μm，放大图10 μm。（G）MI后第28天梗死边缘区CD31免疫荧光染色（绿色）及毛细血管密度定量分析（n=6）。比例尺：20 μm。（H，I）梗死边缘区ZBTB7A和PKM2蛋白水平的Western blot分析（n=4）。（J）PbEE@MN处理后6、8和10周小鼠心脏H&E染色代表性图像。比例尺：50 μm。（K）MI小鼠经PbEE@MN处理后，心脏中Desmin、Vimentin和Calb2的qRT-PCR分析（n=4）。（L）微针释放后第14天收集残留EVs，并采用纳米颗粒追踪分析（NTA）进行定量（n=4）。（M）处理后第28天主要器官（肝、脾、肾、脑、肺）的H&E染色代表性图像（n=3）。比例尺：200 μm。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3.10 安全性评估

鉴于EVs中某些miRNAs可能存在致瘤风险，从而可能危及疗效，我们进一步评估了基于PbEE疗法的安全性情况。通过H&E染色进行的组织学检查显示，用PbEE@MN治疗6、8和10周后，心脏组织均未出现形态学异常。与这些发现一致的是，对已确立的心脏肿瘤标志物（包括Desmin、Vimentin和Calb2）进行qRT-PCR分析显示，与对照组相比并未见显著上调，这表明在10周的治疗期内不存在致瘤活性。此外，体外释放研究表明，系统中的几乎所有EVs在14天后均被释放，表明长期滞留风险极低。此外，对肝脏、脾脏、肾脏、大脑和肺组织的H&E染色显示没有显著的细胞死亡或炎症浸润，这也为多器官安全性提供了支持。综合而言，这些结果表明，负载PbEE的GelMA微针贴片代表了一种增强MI后心脏再生和修复的安全有效策略。

【Citation】:Liu Y, Li S, Cai A, et al. Photobiomodulation-reprogrammed extracellular vesicles delivered via a biodegradable microneedle patch promote cardiac repair by enhancing glycolytic metabolism.Acta Pharmaceutica Sinica B.2026.

【贡献】★★★★★

总之，本研究系统地表征了PbEE的心肌保护特性，这是一种在绿光照射下由hESCs衍生出的新型EVs。我们的研究结果表明，与天然EVs相比，PbEE对心肌缺血性损伤表现出更优越的保护功效。在机制上，PbEE向心肌细胞（CMs）递送了丰富的miR-423-3p，随后通过miR-423-3p/ZBTB7A/PKM2轴增强糖酵解通量，最终促进心肌细胞增殖并抑制细胞凋亡。此外，我们将PbEE封装到基于GelMA的微针（MN）贴片中，建立了一个稳定的EV递送系统。与直接心肌内注射相比，负载PbEE的微针贴片实现了EV的持续释放，并对心肌梗死（MI）发挥了卓越的治疗效果。

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