Nature Plants | 兰州大学胡冲团队揭示蛋白酶EPPs通过加工EPF1/2小肽调控拟南芥的气孔图式发育

气孔是植物表皮特化形成的孔状结构，在拟南芥叶片表面，成熟的气孔由一对保卫细胞构成，保卫细胞能够快速调节胞内渗透压变化以实现气孔精准的开闭。因此，气孔在表皮合理的排布模式对于协调CO2的摄取和减少水分流失之间的动态平衡至关重要。在拟南芥中，由表皮模式建成因子EPIDERMAL PATTERNING FACTOR (EPF) 与ERECTA家族受体 (ERf) 介导的信号通路是气孔图式发育正常建立的关键调控模块。与大多数小肽类植物激素类似，EPF1和EPF2需要经过蛋白水解加工，才能从无活性的前体肽转变为具有生物学功能的成熟肽。然而，与ERf下游清晰的信号级联反应不同，EPF1/2小肽如何从前体肽加工为有活性的成熟肽的分子机制尚不清楚。

近日，兰州大学生命科学学院胡冲教授团队NaturePlants在线发表了题为“Subtilase-mediated maturation of EPF1 and EPF2 is crucial for stomatal patterning”的研究论文。该研究首次鉴定到一组负责加工EPF1/2前体的丝氨酸蛋白酶EPPs (EPF-PROCESSING PROTEINASES)，系统阐明了EPPs通过加工EPF1/2小肽前体使其成熟，进而调控植物气孔图式发育的分子机制，填补了气孔发育信号通路上游小肽加工机制的关键空白。

近年来的研究表明枯草杆菌丝氨酸蛋白酶Subtilisin-like proteinases (SBTs)在小肽类植物激素的剪切加工过程中发挥着关键作用。该团队采用反向遗传学的手段构建了SBTs不同进化分支的高阶突变体。在表型筛选过程中，发现SBT第一亚家族的六重缺失突变体展现出气孔数目急剧增多且成簇分布的表型，而这一表型与小肽EPF1/2和受体ERf缺失突变体的表型高度相似。由此推测这组丝氨酸蛋白酶可能参与EPF1/2的加工，并将其命名为EPF PROCESSING PROTEINASES (EPPs)。进一步通过对各个组合的epp五重缺失突变体进行表型分析结合不同EPP的遗传回补实验，证实EPP1、EPP5和EPP6是调控气孔图式发育的主效成员（图1）。

图1 EPP1/5/6作为主效基因调控气孔发育

为了证实EPPs是否参与EPFs–ERf信号通路调节气孔模式建成，研究人员首先在epp1/2/3/4/5/6、epf1/2和er-105 erl1/2突变体中检测了气孔发育中的核心调控元件SPEECHLESS (SPCH)、MUTE、FAMA和TOO MANY MOUTHS (TMM)的表达情况，发现这些核心调控基因在这三个突变体中均展现出相似水平的上调，初步表明EPPs与EPFs–ERf可能处于一条信号通路。在此基础上，研究人员在epp1/2/3/4/5/6六重缺失突变体背景下分别表达持续激活形式的下游元件YODA (YDA-CA)、MKK4 (MKK4DD)和MKK5 (MKK5DD)，发现均可显著抑制气孔的产生，进一步证实EPPs与EPFs–ERf同处一条信号通路并且在YDA上游发挥作用。最终，该团队构建了epp1/2/3/4/5/6 epf1/2八重缺失突变体，发现epf1/2的突变并不能增强epp1/2/3/4/5/6六重缺失突变体的表型，这一结果从遗传上直接证明EPPs与EPFs位于同一条信号通路（图2）。

图2 EPPs与EPF1/2–ERf同处一条信号通路调控气孔发育

鉴于EPPs属于已被证实参与植物小肽剪切加工的丝氨酸蛋白酶SBT家族，作者推测其可能作为加工EPF1/2前体的关键蛋白酶。为了证明这一猜想，该团队合成了预测的EPF1/2成熟肽(mEPF1/2)，并分别外源处理Col、epf1/2、er-105 erl1/2和epp1/2/3/4/5/6观察它们对小肽处理后的响应。结果显示，mEPF1/2能够显著抑制Col、epf1/2和epp1/2/3/4/5/6气孔的产生，但无法抑制er-105 erl1/2气孔的产生，这一结果直接证明EPPs对于EPFs的加工成熟至关重要（图3）。

图3 epp1/2/3/4/5/6的气孔图式发育缺陷可以通过施加成熟的EPF1/2得到改善

随后，该团队通过体内、半体内和体外的蛋白酶-小肽切割实验，证实EPPs可以加工EPF1/2前体，使其被加工为更小分子量的成熟肽。接下来，研究人员对EPF1/2在体内加工的条带进行质谱分析，鉴定到EPPs加工EPF1和EPF2肽段的N端切割位点，且该位点位于预测成熟肽区域上游。在此基础上，研究人员将这些切割位点进行突变后发现，EPPs对点突变形式EPF1/2前体的加工能力显著下降，证实上述位点为EPPs介导EPF1/2前体加工成熟所必需（图4）。

图4 EPPs可以在体内、半体内和体外加工EPF1/2

为阐明EPPs依赖的EPF1/2加工过程在气孔发育中的生理功能，研究人员分别在Col、epf1/2和epp1/2/3/4/5/6背景下过表达EPF1/2前体基因。结果显示，过表达EPF1/2可有效抑制Col和epf1/2气孔的产生，但无法抑制epp1/2/3/4/5/6气孔的产生，说明EPPs对EPF1/2前体的加工过程对EPF1/2发挥生物学功能至关重要（图5）。

图5 过表达EPF1/2不能抑制epp1/2/3/4/5/6突变体的气孔产生

综上所述，该研究发现一组负责加工EPF1/2前体肽的丝氨酸蛋白酶EPPs，通过位点特异性的剪切加工，将无活性的EPF1/2前体加工为具有生物学活性的成熟肽，精准调控拟南芥气孔的图式发育。该工作不仅揭示了EPF1和EPF2小肽体内加工成熟的关键酶EPPs，更重要的是通过高精度的生化与质谱数据，为EPF1和EPF2成熟肽的真实序列提供了直接的实验证据，纠正了领域内的预测偏差，为深入理解植物小肽信号的加工机制与气孔发育调控网络提供了重要理论基础。

兰州大学博士研究生孟繁辉为论文第一作者，胡冲教授为通讯作者。兰州大学青年研究员朱亚芬，博士研究生黄舒婷、刘宁和刘春泽，硕士研究生文君、赵思佳和王子桐，广州大学李美珍博士也参与了部分研究工作。兰州大学长江学者特聘教授苟小平给与了非常重要的指导。该研究工作得到了国家自然科学基金、兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金、甘肃省科技计划项目基金和教育部细胞活动与逆境适应重点实验室基金等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41477-026-02297-6