Science丨Src激酶通过胞吐作用来到肿瘤细胞表面成为抗体治疗新靶点

撰文丨章台柳

癌症靶向抗体疗法通常要求蛋白质水平的显著上调，或者产生一个全新的表位——例如源自基因突变或异常的翻译后修饰。研究显示，蛋白质错误定位使得细胞内蛋白能够通过某种未知机制易位至细胞表面，使其成为 可靶向 的位点，挑战了“只有经典分泌型或膜结合型靶点才适合作为免疫治疗候选对象”的传统范式。

越来越多的证据表明，某些蛋白激酶会被分泌至细胞外空间，并发挥功能。理论上，这些胞外激酶有可能在肿瘤微环境中过度磷酸化细胞外蛋白，因为肿瘤微环境中细胞外 ATP 丰度极高（高达 1mM ），远超激酶典型的米氏常数（ Km ，对底物的亲和力）；而正常组织中的 ATP 水平约为 1 0 nM 。例如，将 CK 2 与 anti - HER 融合使其靶向过表达 HER 2 的细胞，导致多种癌症相关表面蛋白（包括 CD 44 、 Galectin -3 和 CD 109 ）发生磷酸化。那么，这种胞外激酶是否存在 于 肿瘤细胞表面？

近 日 ， 来自 UCSF 的 James A. Wells 团队 在 Science 杂 志上发表文章 Autophagolysosomal exocytosis inverts Src kinase onto the cell surface in cancer ，发现Src激酶作为一种通常通过其N-豆蔻酰脂质锚定在质膜内叶的主调控激酶，在癌症中（无论是体内还是体外）通过自噬溶酶体胞吐作用（ALE）均发生了非经典易位并翻转至细胞表面，同时其他N-豆蔻酰化的细胞内蛋白也以类似的方式被易位。 此外，在 原发性肿瘤中 也 发现这种细胞外膜相关 Src （ eSrc ），并且基于抗 Src 抗体的疗法在细胞培养系统和小鼠异种移植模型中均介导了肿瘤细胞的杀伤。因此，以Src为代表的细胞内N-豆蔻酰化蛋白，在癌症中可以发生拓扑翻转至细胞表面，并成为抗体疗法的靶点。

研究人员 利用 更高分辨率的光邻近标记蛋白质组学（PLP）技术，如 μMap 和 MultiMap ，用于触发短程反应性生物素 - 卡宾标记， 来 描绘细胞表面蛋白质组。利用 PLP 技术，鉴定出 738 种表面蛋白，从中筛选出 28 种蛋白激酶。 其中包括与癌症相关的酪氨酸激酶 Src ，以及其他 Src 家族激酶： Fyn 、 Yes 和 Lyn 。 虽然之前有报道在癌细胞系的培养基中发现分泌的 Src ，但 Src 存在于细胞表面的现象还未报道过。鉴于这些酪氨酸激酶的存在，使用癌细胞系 HCC 1569 检测细胞表面是否会发生酪氨酸磷酸化。使用流式细胞术检测出细胞表面具有抗磷酸酪氨酸（ anti - pY ）信号，使用 Src 抑制剂可显著降低 anti - pY 信号。此外在表面蛋白质组学检测到的 Src 家族激酶中， Src 在 HCC 1569 细胞中的转录水平最高。 同时鉴定出细胞表面存在 Src 激酶底物，使用重组 Src 激酶结构域处理 HCC 1569 细胞可导致细胞增殖增加，表明 Src 介导的细胞外 pY 磷酸化会对细胞产生功能影响 。 细胞 质 Src （ cSrc ）通常通过其 N 端豆蔻酰化脂质锚定在质膜的内叶 。为了确定胞外 Src （ eSrc ）的定位，使用 anti - Src 抗体来检测细胞表面和培养基，发现在培养基中并未检测到 Src ，而在细胞表面有强表达的 Src ， 这表明 cSrc 发生了明显的翻转，从质膜内叶转移到了细胞表面。 对 多种癌症来源细胞系、健康组织的永生化模型、健康供体来源的外周血单个核细胞（PBMCs）、健康人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以及健康原代膀胱上皮细胞（BdECs） 检测 eSrc 细胞表面表达，发现 大多数测试的永生化细胞系均表达 eSrc ； 而在健康供体的 PBMCs 、 HUVECs 或 BdECs 上则未检测到 eSrc ，虽然细胞内含有非常高水平的 cSrc 。在永生化及癌细胞系中， eSrc 的表达与总 Src 蛋白表达高度相关，但在健康的 HUVECs 和 BdECs 中未观察到这种趋势。搜集临床肿瘤样本，发现在 1 0 例原发性膀胱肿瘤的活肿瘤细胞均表达 eSrc 。

那么， Src 如何转移至细胞表面？ 研究发现，在 自噬体生物发生过程中，来自质膜的 cSrc （或来自细胞质新近 N- 豆蔻酰化的 cSrc ）在自噬体闭合前会出现在其两侧；这些自噬体随后被运输并与溶酶体融合，导致 Src 位于自噬溶酶体的内叶。随后，通过溶酶体胞吐作用， eSrc 与其他溶酶体标记物一起展示在质膜上。 其中 N - 豆蔻酰基团 可介导 Src 与自噬体的结合。同时，研究人员对其他 N- 豆蔻酰 化蛋白进行检测，在细胞表面鉴定出 3 4 种已知的 豆蔻酰 化蛋白，其中大多数尚未被注释为胞外蛋白。通过活细胞流式细胞术独立验证了其中三种位于内叶的 N- 豆蔻酰化蛋白（ Lyn 、 MARCKS 和 OAS2 ）确实存在于细胞表面 。即 N- 豆蔻酰化蛋白 可以通过 自噬溶酶体胞吐作用 的机制被非经典地展示在细胞外 。

肿瘤细胞中 Src 表达会增加，同时自噬溶酶体胞吐作用介导 eSrc 易位，这提示 eSrc 可能是一种潜在的肿瘤特异性抗原。研究人员利用 Fab 噬菌体文库分离出一种针对人 Src 激酶结构域的重组抗体（ Ab 1 ）， Ab 1 能结合表达 eSrc 的细胞，这种结合是特异性的。 进一步表征显示， Ab 1 在荷瘤小鼠体内循环过程中，在肿瘤中高度定位。随后研究人员尝试将 Ab 1 工程化为多种治疗形式，来评估 eSrc 作为靶点的可及性和疗效。将放射性同位素（如发射 α 粒子的 225 Ac ）通过螯合剂偶联到抗体上，可能作为一种放射配体疗法（ RLT ）实现强效杀伤，因为每个细胞只需少数几次 α 粒子发射即可产生细胞毒性。在 HT-1080 荷瘤小鼠中，剂量仅为 0.6μCi 的 225 Ac 即可导致 肿瘤消退（ 16 只中有 2 只）或肿瘤生长速率的大幅降低（ 16 只中有 14 只）。初次给药未观察到急性毒性或体重减轻；然而，后续剂量观察到了肝脏毒性，这与已知的小鼠一般辐射耐受性一致 。 通过将 Ab 1 的 Fab 片段与 CD 3 结合臂进行融合构建了双特异性抗体，来评估 eSrc 作为 T 细胞衔接器（ TCE ）靶点的潜力。体内和体外的检测显示，抗 Src - TCE 显著抑制肿瘤生长。由于 eSrc 缺乏内吞途径，其不适合作为 ADC 药物开 发的靶点。即 eSrc 是一个基于抗体疗法（特别是 TCE 和 RLT ）的具有治疗相关性的靶点。

总的来说，这项研究揭示了以Src为代表的细胞内N-豆蔻酰化蛋白，在癌症细胞中通过自噬溶酶体胞吐作用发生非经典易位并翻转至细胞表面。同时鉴定出eSrc可作为癌症靶向抗体疗法的靶点。

https://doi.org/10.1126/science.aec1778

制版人： 十一

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