用于阿尔茨海默病精确靶向和协同治疗的杂化薄膜包裹纳米粒

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血脑屏障(BBB)限制了大多数神经疾病(NDS)治疗药物的应用。来源于不同细胞类型的杂化细胞膜包裹纳米粒可以模拟来源细胞的表面性质和功能，进一步提高其靶向精度和治疗效果。神经炎症在各种NDS，尤其是阿尔茨海默病(AD)的发病机制中起着越来越重要的作用。在本研究中，通过与高表达趋化因子(C-C基序)受体2(CCR2)的细胞杂交，设计了一种新型的细胞膜涂层，以跨越血脑屏障和靶向神经炎性病变。总的来说，杂化细胞膜包裹的纳米材料为精确的药物输送和疾病特异性靶向提供了新的机会，这代表了AD靶向治疗的通用平台。

1.CCR2-RFP位于细胞膜上，介导对CCL2的趋化作用

首先，作者团队提出了一种使用纳米技术的原创战略(图1)。我们通过将血小板膜和高表达CCR2的膜结合起来，开发了一种杂交系统，并将两种小分子药物(雷帕霉素和TPPU)负载到这些杂化脂质体上，以靶向和治疗与AD相关的脑内病理区域。

图1 载药杂化细胞膜脂质体的制备方案及其在AD治疗中的应用。

为了标记CCR2蛋白，我们将其与RFP(MScarlet)融合。首先，将编码融合蛋白基因的质粒导入HEK293T细胞。CCR2-RFP大小约为70 kDa(图2A)，定位于细胞膜(图2B)，表明RFP不改变CCR2的表达或细胞定位。我们构建了CCL2的表达载体，用WB检测过表达的蛋白(图2C)。如图2D、E所示，当下室含有更多的血清或CCL2时，迁移的细胞数量显著增加。这些结果表明，CCR2-RFP定位于细胞膜上，并对其配体CCL2具有趋化作用。

图2 CCR2-RFP的表达、亚区化和趋化作用。

2.杂化细胞膜的制备与表征

作者团队进一步印迹了位于血小板(图3A)和CCR2-RFP HEK293T细胞(图3B)膜上的标记蛋白。CD41、CD61和CD62P三种分化抗原(CD41、CD61和CD62P)丰富于血小板细胞膜(图3A)。在HEK293T细胞中，CCR2-RFP和Na-K-ATPase在细胞膜上的表达明显高于其他成分。此外，RFP广泛分布于细胞膜和细胞质中(图3B)。然后，我们制备了细胞膜杂化脂质体，Western blotting证明杂化细胞膜共表达了在血小板和HEK293T细胞中发现的标记蛋白(图3C)。我们发现细胞膜杂化脂质体以不同的比例在所有三组中强烈共定位(图3D，E)。即成功地合成了表达特征性膜蛋白的共定位杂化细胞膜。

图3 血小板膜和CCR2-RFP HEK293T细胞膜的提取及杂交。

3.载药杂化细胞膜脂质体的制备与表征

通过透射电子显微镜观察杂化脂质体(图4A，B)。无论杂化细胞膜脂质体中是否含有药物，它们都保持了囊泡结构。然而，含有两种药物(TR@CPL和TR@PL)的杂化脂质体的粒径大于其他脂质体(图4C)。这七组的Zeta电位大致相似(图4D)。当雷帕霉素和雷帕霉素同时加入时，载药率继续增加(图4E)，两种药物的最佳剂量比为100：64μgmL−1(雷帕霉素：雷帕霉素)(图4F)。在72小时内，TPPU和雷帕霉素的累积释放量分别约为30%和40%(图4G，H)。

图4 载药杂化细胞膜脂质体的特性。

为了验证杂化脂质体是否可以通过血脑屏障并在体内迁移到炎性病变，在3个月龄的5xFAD小鼠体内注射了DiR标记的脂质体。在大脑中可以检测到荧光，信号在12小时达到峰值(图5A)。比较不同比例的血小板和CCR2-RFP HEK293T细胞膜，第3组(血小板CM：HEK293T CM=2：1)的通过率显著高于其他组(图5B)。除了在脑中浓缩外，脂质体还在肝、脾和肾中浓缩(图5C)。与注射RFP HEK293T-血小板杂化膜组相比，注射CCR2RFP HEK293T-血小板膜杂化脂质体的脑组织在小胶质细胞(图5D，E)和星形胶质细胞(图5F，G)周围有脂质体聚集。这表明CPL能够靶向炎性病变。

图5 杂化细胞膜脂质体的生物分布和靶向效应。

4.载药杂化细胞膜脂质体改善AD症状的体内外实验研究

5xFAD小鼠在3个月大时开始接受治疗，每周三次尾静脉注射。治疗6周后，对小鼠进行行为学测试。然后，我们提取组织用于后续实验(图6A)。旷场测试用于评估运动功能、探索行为、焦虑和抑郁。在速度、移动距离或在中心区停留的时间方面，两组之间没有显著差异(图6B-D)。我们选择了NOR测试来评估短期记忆。只有给予TR@CPLs显著改善了5xFAD小鼠的认知(图6E，F)。对于长期记忆，根据MWM测试，在训练第5天到达平台的潜伏期在四组中显著缩短(图6G，H)。在最终的测试中，我们发现载药的杂化细胞膜脂质体改善了认知缺陷(图6I，J)。使用TR@CPLs治疗的组比其他治疗组更有效(图6I)。

图6 不同脂质体对5xFAD小鼠的行为学测试。

5.载药杂化细胞膜脂质体减少淀粉样斑块和减轻神经炎性反应

行为测试结束后，我们对脑组织进行了一系列的病理测试。T@CPL组和TR@CPL组APP表达明显减少(图7A，B)，但tau病理改变不明显(图7A，C)。由于雷帕霉素的靶标是自噬，我们还检测了标记LC3II/I，发现其在R@CPL和TR@CPL组中的表达增加(图7A，D)，这表明雷帕霉素促进了自噬。接下来，我们使用免疫荧光观察了淀粉样斑块。所有四组脂质体在大脑皮层和海马区都有中等程度的病理蛋白负荷，其中TR@CPL显示出最显著的治疗效果(图7E-G)。此外，我们想知道脂质体是否可以减轻神经胶质细胞所反映的神经炎症。T@CPL组、TR@CPL组和TR@PL组大鼠脑内胶质细胞浸润较少(图7H-J)。此外，与TP@PLs相比，TP@CPL显著减少了胶质细胞聚集的数量(图7H，I)。这一结果表明，TPPU具有潜在的抗炎作用，特别是当与CCR2过表达的细胞膜涂层结合时。

图7 载药杂化细胞膜脂质体减少淀粉样斑块和减轻神经炎症。

结论

在本研究中，我们创新性地设计了一种包裹在细胞膜涂层中的混合脂质体系统来治疗阿尔茨海默病。我们阐明了这种新型纳米载体通过有效的血脑屏障来精确靶向大脑内的炎性病变的潜力。随后，我们的研究成功地将两种不同的治疗剂雷帕霉素和TPPU包裹在杂化细胞膜包裹的脂质体中，从而促进了针对AD的协同和多靶点治疗策略。体外和体内实验结果表明，载药细胞膜杂化脂质体在治疗阿尔茨海默病方面具有显著的治疗潜力。我们的发现表明，细胞-膜包衣混合脂质体系统有可能开发出有效、精确和多靶点的AD治疗方法。这为更有效的治疗方案和更个性化的治疗策略打开了大门。

作者提示: 个人观点，仅供参考

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