PLA服务样本前处理指南

一.样本&试剂寄送要求

二．贴壁细胞制备Protocol

1、在超净台内，使用75%乙醇擦拭外包装铝箔袋
2、拆开铝箔袋，取出内置器皿后，用尖镊将内置爬片取出放入所用培养板或培养皿内，
3、用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）
4、种植细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
5、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。
6、使用细胞爬片时，（比如在6孔板钟放入爬片，6孔板的孔底面积往往比爬片面积多出一部分，加细胞悬液时，常常就是细胞铺满整个孔底，有时，细胞生长边集现象，就是靠近壁边缘细胞密度要高一些，这样处于中央细胞爬片上的细胞数量相对较少），比较好的做法是，将爬片放入孔内后，加细胞悬液时，只滴到爬片上，一直滴到液体布满整个爬片，但又不易溢出爬片边缘，放到培养箱里，等细胞贴壁后，取出，再滴加培养基布满整个孔底，继续培养，这样爬片上的细胞生长的密度就会很集中。
7、细胞放到爬片上，之后加任何试剂，都应沿培养板板壁少量一点点倒入液体，直到细胞被液体淹没，尽量不要把细胞冲到细胞爬片以外！
8、作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
9、细胞爬片，有多层包装，在超净台无菌状态下打开包装，未用完的爬片按照原先包装方式再包装起来即可。
10、爬片表面带有正电荷，请勿用手触摸，以免效果不佳！

三．悬浮细胞制备Protocol

取悬浮细胞液，1500-3000rpm离心5min，离心管底部能看到白色细胞团，弃上清；PBS清洗两遍，离心收集清洗好的细胞，弃上清；加入固定液，重悬，室温固定15-20min。

四．常见细胞容器对应细胞培养量及抗体体积

五．细胞样本关键注意事项

1、爬片消毒：必须彻底，75% 酒精消毒后需用 PBS 充分洗涤，避免酒精残留导致细胞死亡

2、固定：避免使用甲醇 - 丙酮混合液固定，适合膜蛋白但易使细胞皱缩，但会破坏脂质和膜结构。固定剂首选4%多聚甲醛，适合膜蛋白和大部分胞内蛋白，但可能掩盖磷酸化表位，固定后务必PBS洗3次（每次5分钟），彻底去除残留固定剂。

3、细胞吸附：多聚赖氨酸包被不充分或细胞静置时间不足会导致细胞脱落，若细胞吸附效果差，可延长静置时间至 45min，或提高细胞浓度。

4、细胞密度控制：不同细胞系的生长速度和贴壁能力差异较大，建议细胞在爬片上生长至 50%～70%汇合度，密度过高会导致细胞重叠，不便于清晰观察单个细胞的形态和结构影响后续染色观察；密度过低则细胞数量不足，实验结果不稳定。

5、对照设置：设置阴性对照，排除非特异性染色干扰。

6、制备细胞样本的时候建议一个组别多送几个样本，实验前都会观察选取细胞状态好的使用。

六．孔板耗材推荐

1.多聚-D-赖氨酸包被细胞培养板（细胞贴壁速度更快，贴壁更牢）

如：细胞爬片（12孔板，直径20mm，圆形）

2.共聚焦爬片（防止运输过程中爬片移动）

3.腔室载玻片

如：腔载玻片（1格，TC处理，无菌无酶）