CAR-T疗法细胞免疫原性评估的BMS视角

免疫原性评估是CAR-T细胞治疗药物临床试验的重要组成部分。自体T细胞疗法给药后，可能同时引发先天性与适应性阶段的免疫反应。CAR-T细胞的免疫原性主要源于CAR中异源序列的固有风险，例如CAR的抗原识别结构域可能是鼠源人源化的单链可变片段（scFv），并非完全人源化。

除诱导抗体反应外，CAR中的此类异源序列还可驱动MHC I类分子介导的CD8⁺细胞毒性T细胞反应。凋亡或坏死CAR-T细胞释放的CAR肽段，可通过MHC I类和II类分子呈递给初始T淋巴细胞，可能在外周启动T细胞反应，随后这些T细胞归巢至次级淋巴器官，分别诱导细胞毒性CD8⁺T细胞和效应性CD4⁺T细胞的产生。其中，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可能通过识别MHC I类分子呈递的CAR片段来清除CAR-T细胞，进而影响CAR-T细胞的扩增与存续。

评估针对CAR-T结构域以及细胞产品残留物（如AAV、CRISPR/Cas9、适配体等）的CTL反应，或有助于解释CAR-T细胞存续性的变化。卫生监管机构建议通过此类检测，评估机体针对CAR-T蛋白可能产生的体液免疫与细胞免疫原性。

CAR-T细胞免疫原性的评估现状与参考依据

在抗CAR-T抗体反应评估方面，可借鉴生物制剂抗药抗体（ADA）配体结合试验的成熟指导原则（Immunogenicity testing of therapeutic protein products-Developing and validating assays for anti-drug antibody detection. FDA, 2019），但目前针对细胞免疫原性评估尚无明确指南。

对于CAR-T中与CMC相关的外源性风险，可通过先天性免疫反应检测进行评估，该方法与用于评估宿主细胞蛋白、聚集物等关键质量属性风险，以及先天性细胞受体（如模式识别受体）机制性结合风险的方法极为相似。

监测抗原特异性CTL反应是疫苗和基因疗法开发中的常规手段，行业内已形成统一的最佳实践与建议，这些经验可适用于CAR-T细胞疗法的相关评估。

CAR-T细胞免疫原性的主要评估方法与应用

酶联免疫斑点（ELISpot）检测在细胞免疫原性评估中应用最为广泛，其他评估方法还包括靶向细胞裂解检测（如铬释放试验、基于阻抗的检测）和细胞因子释放评估（如生物发光检测、流式细胞术）。

在疫苗和基因疗法的开发实践中已证实，利用ELISpot技术检测IFN-γ分泌，是多中心临床试验中灵敏度高且可行性强的免疫监测工具之一。然而，与疫苗开发中的CTL检测不同，CAR-T疗法中的同类评估面临诸多挑战，主要原因包括：1）技术可行性与样本物流问题；2）CAR-T设计中的内源性与外源性因素；3）输注前治疗的影响；4）患者特异性因素。

一、技术与临床试验相关挑战

（一）样本处理与物流的核心难题

评估CAR-T疗法细胞免疫原性的主要挑战之一是外周血单个核细胞（PBMC）中CAR特异性CTL丰度极低，尤其是在淋巴清除术后初期。因此，在CAR-T临床试验中应用ELISpot检测，需建立严格的血液采集、PBMC处理、冷冻及运输方案。优化现有流程以适配CAR-T特异性细胞评估需求，关键在于确保有足够数量的活细胞，通过检测分泌的细胞因子在体外引发CAR-T结构域特异性反应。

在大型多中心临床研究中，保障细胞存活与功能的物流环节要求PBMC及时分离、冷冻和运输。此外，ELISpot检测需5-10mL的大量血液以实现最佳PBMC分离，这对于已接受淋巴清除和免疫抑制预处理以准备CAR-T输注的患者而言，无疑加重了其负担。通常，全血需在温控容器中隔夜运输至中心实验室处理制备PBMC，随后在液氮中长期储存以备批量检测。PBMC分离的任何延迟都可能导致粒细胞污染，干扰T细胞反应性。运输温度波动与PBMC分离时机的差异也会造成检测反应的显著变异。

（二）试剂开发与检测优化的实践探索

检测开发中的试剂制备也可能面临挑战，例如阳性对照的获取、CAR-T表达结构域的可及性、用于探测记忆CTL反应的肽段设计与合成等。

基于案例研究总结的临床试验经验显示，最初建立的经验证ELISpot检测方法（检测方法1）旨在通过CAR胞外域（ECD）特异性肽段体外刺激CAR-T给药受试者的PBMC，检测IFN-γ分泌以评估回忆性记忆反应，刺激物采用覆盖CAR-T ECD域的9聚体重叠肽库，植物血凝素（PHA）作为阳性对照。但该检测未能成功评估细胞免疫原性，主要问题包括：1）约30%样本因运输条件不佳、检测前-70°C短期储存及解冻流程导致细胞活力存疑，无法评估；2）大量患者被判定为CAR-T肽段反应阳性，但与临床观察无相关性；3）PHA对照反应不可靠，活性变异大且多数样本计数未达可接受标准。

为改进评估效果，新的IFN-γ ELISpot检测方法（检测方法2）在验证前严格控制温度、运输频率等影响样本完整性的因素，并优化检测流程，引入细胞适应步骤，冷冻PBMC解冻后静置24小时再与覆盖整个CAR-T构建体的15聚体重叠肽段（偏移5个氨基酸，浓度2μg/mL）共培养。肽段长度增至15聚体不仅减少了刺激物中的肽段总数，还支持MHC I类和II类分子呈递，使CD8⁺T细胞和CD4⁺Th1细胞均能分泌IFN-γ。此外，设计两组肽库分别覆盖胞外区和胞内区（如下图），细胞与肽段在优化条件下孵育24小时，同时设置PHA蛋白、巨细胞病毒/EB病毒/流感病毒（CEF）HLA I类肽库作为阳性对照，单独细胞作为阴性对照。该检测经验证的动态范围为1-700个斑点形成单位（SFU）/孔，还确定了检测限、精密度、耐用性和稀释线性等参数，结果以每百万PBMC的平均SFU表示。

（三）储存条件与细胞特性的影响分析

研究通过评估PBMC液氮储存时间与IFN-γ SFU功能反应的相关性，以及细胞活力对阳性对照（PHA、CEF）刺激后IFN-γ分泌量的影响，发现储存时间延长和细胞死亡增加对活细胞响应阳性对照刺激的能力无显著影响。但对于人源scFv等低抗原性分子，因抗原特异性细胞数量少，检测仍具挑战，故强阳性对照（PHA、CEF等）与低抗原性对照（CAR-T肽段）的样本储存/处理建议需有所差异。此外，即使活细胞数量少，强阳性对照刺激仍可能产生可检测的IFN-γ反应，但相同条件下CAR-T肽段刺激未必如此。

BMS初步研究结果显示，部分受试者在CAR-T输注2个月后，存在由CAR-T结构域特异性肽段诱导的低水平CAR-T特异性CTL反应。此类评估若具有显著性和影响力，或可助力绘制免疫原性结构域，为下一代CAR优化提供依据，但需通过正交检测验证CTL反应的存在与否。相比之下，该研究中CAR-T输注4个月后检测到强烈体液免疫反应，50%以上受试者在4-10个月间产生针对CAR构建体ECD的ADA，提示高体液免疫原性。

（四）治疗背景下的细胞免疫应答特征

血液系统恶性肿瘤CAR-T治疗中，细胞免疫应答的发生受多种因素影响，包括CAR-T细胞扩增动力学、输注前淋巴清除导致的暂时性免疫抑制，以及启动MHC I类和II类限制性T细胞反应所需免疫组分的延迟重建。因此，CTL或效应T细胞活性及其对CAR-T细胞存续性和疗效的影响，可能在单次给药后不明显，仅在免疫重建或反复抗原暴露后才显现。

二、CAR-T相关外源性因素

CAR-T细胞制备过程中的多种外源性因素可能诱导体液和细胞免疫反应，包括：1）将CAR序列递送至T细胞的慢病毒、腺相关病毒（AAV）等病毒载体成分；2）用于自体和异基因CAR-T细胞基因编辑的CRISPR/Cas9；3）含异源非自身表位的自杀/安全开关；4）制备中用于调控T细胞扩增和激活的适配体。对于异基因CAR-T，还需考虑HLA错配引发的混合淋巴细胞反应、为改善植入而转入的HLA E等因素。

三、CAR-T输注与治疗相关因素

血液系统肿瘤患者在CAR-T输注前需接受淋巴清除处理，以创造利于CAR-T细胞扩增和存续的微环境，减少与现有免疫细胞的竞争以提升疗效。但淋巴清除为细胞免疫原性的产生和检测增加了额外复杂性。骨髓中免疫细胞的诱导和增殖需要时间，且重建的免疫细胞易受细胞因子抑制剂、类固醇等标准治疗药物的免疫抑制影响——这些药物用于管理细胞因子释放综合征等输注相关不良反应。此类治疗具症状导向性，个体差异大，故对体液和细胞免疫应答的影响各不相同。研究观察到患者对CAR-T ECD域的抗体反应始于2个月，6个月左右达峰，这种延迟反应可能与淋巴清除后免疫细胞重建及足够扩增时间相关。在此情况下，难以评估患者免疫系统对“异源”CAR-T构建体产生免疫应答的能力，也无法确定检测到的反应是否为“治疗相关性”应答。

四、患者特异性因素

CAR-T治疗血液系统肿瘤后的长期缓解与初始应答深度、肿瘤特征、循环CAR峰值水平及淋巴清除化疗相关。患者特异性因素也会影响对CAR-T构建体的细胞免疫应答，包括：多数患者已接受过放疗、类固醇、化疗、干细胞移植及免疫检查点抑制剂等多线治疗，这些治疗会损害免疫系统，尤其影响循环PBMC及免疫细胞处理和呈递抗原至MHC复合物的能力。部分患者可能因接受过与CAR构建体共享表位的生物制剂治疗而产生免疫预激，形成可被激活的记忆应答。疾病状态/患者因素及细胞脆弱性可能导致PBMC体外制备中冻融过程的细胞死亡。即使体外活力未受影响，细胞功能也可能受损，在后续培养中对刺激无反应或发生凋亡，导致检测结果显著变异。CAR-T输注后，有效治疗可能促进患者免疫细胞再增殖和内环境稳态恢复，使PBMC更健康有活力。

五、细胞免疫原性评估的风险导向策略

鉴于细胞免疫应答评估的复杂性、可行性挑战及目前缺乏临床相关影响证据，为CAR-T项目制定风险导向的细胞免疫原性策略十分必要，需考虑以下因素：

（一）免疫原性风险因素与触发机制

驱动体液和细胞应答的免疫原性风险因素可为风险导向的细胞免疫原性评估策略提供支撑。CAR-T构建体的内在风险源于免疫表位的存在，尤其是与MHC I类和II类分子相关的表位。可借鉴治疗性抗体的评估方法，利用ISPRI/epimatrix、NetMHCPan4等计算机算法分析CAR-T序列的潜在免疫原性。某案例中，特定CAR-T构建体（含胞外域、胞内域、信号组件、病毒载体序列及基因编辑非人类蛋白）的总体风险评估为低至中等，但在scFv域的鼠源成分中识别出多个潜在免疫原性新表位，且所有结构域和铰链区均存在大量覆盖广泛HLA单倍型的MHC I类泛结合新表位。这些新表位可用于临床监测细胞免疫应答，也可为下一代构建体的免疫原性优化提供参考。对于新表位含量极高的构建体，风险评估建议在早期CAR-T研究中同时检测体液和细胞免疫原性。后续研究中，若早期临床无免疫原性相关不良事件，可采用“收集并保存”策略推迟或完全避免免疫原性检测。

（二）检测方法的局限性与发展

有效CTL应答需抗原在MHC I类分子呈递下激活初始CD8⁺记忆T细胞，形成长期记忆T细胞应答。CD8⁺细胞的杀伤作用涉及CD8⁺T细胞与CAR-T结构域形成免疫突触、T细胞抗原特异性激活、分泌IFN-γ和TNF-α、向靶细胞释放穿孔素和颗粒酶等一系列过程。因此，ELISpot检测中仅检测IFN-γ等单一分析物，无法全面反映CTL诱导机制或CAR-T细胞杀伤效应。多重细胞因子检测或多色流式细胞术可能更具价值，但为大型多中心临床研究开发和验证此类方法面临挑战。

（三）CAR-T设计演进对免疫原性的影响

第一代CAR构建体采用鼠源scFv序列，免疫原性风险较高。而CAR-T工程技术的改进——包括引入胞内共刺激分子、scFv序列人源化等——显著提升了功能和存续性，降低了免疫原性风险。这些改进使CAR-T构建体中人源生殖系序列比例增加，将针对“异源”序列的免疫应答限制在CDR的小区域，从而大幅降低诱导CTL或体液免疫应答的可能性。

最后

在免疫功能正常的受试者中，评估基因疗法诱导的CTL反应具有可行性，但对于接受CAR-T治疗的癌症患者而言，鉴于其免疫功能受损，且现有平台检测所需的免疫功能正常细胞数量不足，这一评估的可行性存疑。

尽管在基因疗法中，当CTL反应针对病毒载体转导细胞引发肝转氨酶升高等不良事件时，采用此类检测进行原因解释是可行的，且为监管机构所推荐，但细胞免疫应答评估伴随物流难题与患者负担，对于细胞疗法而言未必具有充分合理性。

虽然优化采集时间点、样本处理及肽段设计可改善ELISpot检测对细胞免疫原性的评估效果，但申办方还应考虑开发要求更简化的正交检测方法，例如低血量需求的微流控检测，同时评估集中式生物样本库网络资源共享、短检测周期及多重读数（如TNF-α、穿孔素、颗粒酶）等策略。全血肽段刺激等新型方法可减轻患者采血负担，降低样本处理中的变异。

已获批的血液系统癌症CAR-T疗法的细胞免疫原性评估一致显示，随时间推移反应强度低，且不影响CAR-T细胞动力学、存续性及患者结局，这使得此类评估对CAR-T疗法整体临床开发的价值受到质疑。相反，应基于风险评估采用个案分析的方式判断其必要性。

结合对2种获批细胞疗法的实践经验、免疫原性对细胞扩增与存续影响的深入评估，以及未发现任何与细胞免疫应答相关安全事件的现状，BMS建议，在血液系统恶性肿瘤等已知低风险患者群体的自体CAR-T细胞项目中，可对研究样本进行储存留存。

BMS提出临床开发阶段样本检测的可操作阈值与触发条件：1）计算机模拟评估中存在高分值新表位；2）因既往接触生物制剂或CAR-T疗法而存在交叉反应风险；3）PK、疗效及安全性特征发生变化（如CAR-T输注后存续与扩增不佳，但未检测到体液反应）。

相较于血液系统癌症CAR-T疗法，实体瘤、自身免疫性疾病CAR-T疗法及异基因CAR-T疗法中，细胞免疫原性应答的诱导情况与强度可能存在显著差异，且影响更为重大。在此类情况下，可能需要预先开展细胞免疫原性检测。

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