北航常凌乾团队《Small》：高通量芯片解锁活细胞内蛋白互作的瞬间

导读

蛋白-蛋白相互作用是调控细胞增殖、迁移、信号转导等生命过程的核心机制。深入解析蛋白互作与细胞行为之间的动态关系，对于理解肿瘤发生发展、耐药机制以及开发精准治疗策略具有重要意义。然而，传统检测方法（如Co-IP、Western blot）依赖细胞裂解，只能提供群体平均化的“静态快照”，无法反映单个活细胞内的真实动态。双分子荧光互补技术虽可实现活细胞成像，但其大分子量荧光蛋白标签（>10 kDa）可能干扰蛋白天然功能，且转染效率低，难以实现高通量单细胞分析。

针对活细胞中蛋白互作检测效率低、通量不足等挑战，北京航空航天大学常凌乾、董再再，香港城市大学焦艳丽，北京航空航天大学张靖（共同通讯作者）合作报道了一种名为“Pixar”的高通量单细胞生物芯片系统。该系统集成了蛇形微通道单细胞捕获阵列与纳米孔聚焦电场递送模块，能够同时对数千个单细胞进行精准定位与高效分子递送。通过递送小分子肽标签（His/Flag，<1 kDa）标记的蛋白表达质粒及特异性DNA探针，Pixar系统实现了活细胞中蛋白互作的高灵敏、可视化检测，递送效率与细胞活性均超过90%，成功避免了传统大分子标签对蛋白功能的干扰。基于该系统，研究团队揭示了AKT-mTOR蛋白互作增强对肿瘤细胞迁移和增殖异质性的调控作用，为精准肿瘤治疗提供了新的单细胞层面的理论依据（图1）。成果以“High-Throughput Single-Cell Biochip System for Functional Interrogation of Protein Interactions in Living Cells”为题，发表在《Small》上。论文第一作者为北京航空航天大学生物与医学工程学院博士研究生刘冯、安徽医科大学生物与医学工程学院硕士研究生吴成宝、北京航空航天大学医学科学与工程学院副教授杨超娟、北京航空航天大学生物与医学工程学院博士研究生童一航。

图1. Pixar系统工作原理及单细胞蛋白互作检测流程

Pixar系统首先通过蛇形微通道中的钩状微结构，利用流体偏转力实现了高通量单细胞捕获（>1000个细胞/芯片，捕获效率>90%）。随后，利用纳米孔聚焦电场技术，在30V低电压下实现细胞膜可逆电穿孔，将His/Flag小肽标签标记的AKT和mTOR表达质粒以及特异性DNA探针高效递送至活细胞内（递送效率>96%，细胞活性>98%）。小分子肽标签（<1 kDa）相比传统荧光蛋白标签（>10 kDa）对蛋白天然构象和功能影响更小，同时探针通过适配体特异性识别肽标签，结合链置换信号放大策略，实现了蛋白互作信号4倍增强，检测灵敏度达1 nM（图2）。

图2. Pixar系统单细胞捕获与分子递送性能验证

基于上述技术优势，研究团队利用Pixar系统对AKT-mTOR蛋白互作进行了单细胞水平的动态监测。结果显示，AKT-mTOR互作增强显著促进了肿瘤细胞的迁移和增殖能力，且不同细胞间表现出明显的异质性响应。通过蛋白组学分析，共鉴定出641个差异表达蛋白，GO和KEGG富集分析表明这些蛋白主要参与糖酵解、细胞黏附、代谢调控等通路，揭示了AKT-mTOR互作调控肿瘤细胞行为异质性的分子网络（图3）。

图3. Pixar系统监测AKT-mTOR互作调控肿瘤细胞异质性

为进一步验证Pixar系统的普适性，研究团队选择了另一对经典癌蛋白KRAS-Raf1进行了验证。结果表明，Pixar系统同样能够高效递送KRAS和Raf1表达质粒，并成功检测到二者在活细胞中的特异性互作信号。经KRAS抑制剂处理后，荧光信号显著降低，证实了检测的特异性。以上结果充分证明Pixar系统具有良好的通用性，适用于多种蛋白互作的研究场景（图4）。

图4. Pixar系统在AKT-mTOR蛋白互作检测中的应用验证

综上所述，Pixar系统集高效递送、多靶标检测、长时程单细胞表型监测于一体，为药物筛选、基础生物学研究及个性化医疗提供了全新的技术平台。

文章链接：https://doi.org/10.1002/smll.73336

来源：北京航空航天大学