Plant Journal | 深圳兰科中心王志才和东京大学团队合作利用ngTALEN核酸酶提高DNA甲基化位点的基因编辑效率

除靶基因自身序列因素外，DNA甲基化等表观修饰也严重制约着靶基因编辑效率。DNA甲基化遍在于植物基因组中，与基因表达、染色质重塑等重要的生物学过程相关，通常在胞嘧啶第5位加上甲基化修饰（5mC）【1】。近年来，基因编辑技术极大地促进了基础和应用生物学研究。其中，II型细菌CRISPR系统CRISPR-Cas9和转录因子样效应核酸酶（TALEN）在真核生物中的应用最为广泛。然而，特定位点的甲基化修饰抑制了基因编辑效率，甚至在某些高甲基化位点难以实现有效编辑【2】，给研究者造成困扰。研究表明，TALEN与DNA靶序列的识别机制完全不同于CRISPR-Cas9，其对异染色质的结合和编辑效率优于CRISPR-Cas9【3】。能否利用TALEN的上述优势对编辑元件进行改造，在植物中提高其识别甲基化位点的特异性进而提升基因编辑效率具有重要意义。

近日，深圳市兰科植物保护研究中心（兰科中心）科研人员及其东京大学合作者在植物学国际知名期刊The Plant Journal在线发表了题为Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines的研究论文【4】，开发了利用ngTALEN核酸酶提高DNA甲基化靶位点基因编辑效率的有效方法。

研究人员首先结合单碱基水平甲基化数据，选择开花调控相关Flowering wageningen (FWA) 为靶标基因，针对启动子双串联重复区和基因区甲基化位点分别设计3个靶位点（图A）。相应靶向区域在野生型植物中高度甲基化，而在表观突变体fwa中为去甲基化状态。然后，通过获得CRISPR-Cas9、TALEN、ngTALEN的转基因材料，在重叠编辑窗口、较长时间跨度中考察甲基化对靶基因编辑效率的影响及编辑事件的可遗传性和稳定性。研究结果显示，各编辑器在fwa表观突变体背景下的基因编辑效率显著高于野生型对照，表明甲基化状态抑制基因编辑。与CRISPR-Cas9和TALEN相比，ngTALEN可有效提升甲基化启动子和基因区的编辑效率（图B）。这可能与基因编辑元件的蛋白表达水平无直接联系，因为尽管CRISPR-Cas9在甲基化位点的编辑效率相对较低，其表达水平却高出TALEN和ngTALEN表达水平6倍以上（图C）。通过对约1000个单株进行测序对比分析表明，甲基化抑制CRISPR-Cas9和TALEN基因编辑效率（图D），TALEN较CRISPR-Cas9有明显优势，而ngTALEN对高甲基化位点的编辑效率为最优。因此，该研究开发了应对基因组DNA高甲基化位点的基因编辑工具，为难以编辑位点突变提供了实用工具。

值得注意的是，虽然该研究证明启动子区和基因区甲基化均可抑制基因编辑，并利用ngTALEN有效提高了DNA甲基化位点的编辑效率，但ngTALEN对基因组中普遍存在的其他复杂表观修饰如组蛋白甲基化和乙酰化等位点的编辑作用有限。因此，下一步利用通用型RVD来识别胞嘧啶C和甲基化胞嘧啶5mC，结合对异染色质可及性的调控，可望大幅提升基因编辑元件对复杂表观修饰位点的基因编辑效率。

ngTALEN提升DNA甲基化位点编辑效率。A: 野生型Col-0和fwa-d表观突变体背景下的FWA位点甲基化对比分析模式图。B: 编辑效率对比分析。C: 基因编辑器表达水平对比分析。D. 测序结果汇总对比分析。

深圳市兰科植物保护研究中心副研究员王志才为该论文第一作者，王志才和东京大学有村慎一教授为论文共同通讯作者。该研究得到了国家留学基金委员会访问学者项目的支持。

参考文献：

[1] Erkes, A., Mücke, S., Reschke, M., Boch, J. and Grau, J. (2021) Epigenetic features improve TALE target prediction. BMC Genomics22, 914.

[2] Liu, G., Yin, K., Zhang, Q., Gao, C. and Qiu, J.-L. (2019) Modulating chromatin accessibility by transactivation and targeting proximal dsgRNAs enhances Cas9 editing efficiency in vivo. Genome Biology20, 145.

[3] Jain, S., Shukla, S., Yang, C., Zhang, M., Fatma, Z., Lingamaneni, M., Abesteh, S., Lane, S.T., Xiong, X., Wang, Y., Schroeder, C.M., Selvin, P.R. and Zhao, H. (2021) TALEN outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites. Nat Commun12, 606.

[4] Wang Zhicai, Tamura Yoshiko, Hashimoto Masaru, Nakazato Issei, Yamaguchi-Nishimura Asuka, Arimura Shin-ichi. Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines. Plant J (2026)126, e70826.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.70826