多组学揭示胶质母细胞瘤新型分子亚型并预测免疫治疗疗效

研究概述

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一种高度侵袭性的浸润性恶性肿瘤，目前的治疗手段无法完全治愈。因此，需要更精确的分子亚型特征来预测治疗反应，以实现个性化的精准治疗。本研究利用识别了癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）中GBM样本的表达亚型，并与现有分子亚型进行了比较。本研究对GBM进行了可重复且稳健的分子亚型分类，这些发现有助于识别对免疫治疗有反应的患者，从而改善GBM预后。

研究方法与结果

1、新型GBM分子亚型的发现

在本研究中，作者旨在使用基于BayesNMF的共识聚类方法，在基因组水平上对GBM进行新的分子亚型分类。作者的研究结果表明存在四种新型分子亚型（S1，S2，S3，S4）（图1A）。为了进一步探究这些分子亚型的特性，作者将其与Verhaak等人发现的亚型（前神经元型、神经元型、间质型、经典型）进行了比较。结果发现：S1中46.2%的样本为神经元亚型；S2中82.8%的样本为前神经元亚型；S3中74%的样本为间质亚型；S4中57.9%的样本为经典型亚型。此外，S2与前神经元亚型密切相关，S3与间质亚型密切相关（70.6%的前神经元亚型映射到S2，66.1%的间质亚型映射到S3）（图1B）。这些结果表明，GBM分型与以往的分型高度一致，每种亚型都与特定的表型相关。

图1.四种新型GBM分子亚型

(A)：GBM亚型中标记基因表达的热图；(B)：四种新型GBM分子亚型与前神经元型、神经元型、经典型和间质型亚型的比较。

2、各亚型生物学特征与基因组变异

接下来，作者探讨了四种分子亚型之间的生物学意义，并进行了ssGSEA分析。结果表明，S1表现出低增殖特征，S2和S4表现出高增殖特征，S3表现出高免疫特征。在生存趋势方面，S2和S4的预后比S1和S3差。此外，作者还发现S2表现出低免疫和炎症特征（图2A）。通过TCGA的泛癌基因组学特征分析，四种分子亚型显示出不同的突变谱，其中S3表现出整体更高的非整倍体评分和基质分数（图2B, C）。此外，为了探究这四种亚型与驱动事件（点突变、插入缺失和拷贝数变异）的关联，作者分析了癌症驱动基因和拷贝数变异。结果表明：S2：富集IDH1突变、TP53突变和缺失。S3：富集NF1缺失。S4：富集EGFR扩增/突变（图2D）。

图2. GBM亚型中的生物学通路分析和拷贝数变异分析

3、各亚型的免疫景观

作者还讨论了S1-4亚型的免疫景观。S2显示出较低的巨噬细胞调节、淋巴细胞浸润特征评分、IFN-γ反应和TGF-β反应。相比之下，S3则表现出更高的上述指标（图3A）。免疫系统中的重要分子，包括免疫检查点分子和编码MHC蛋白的人类白细胞抗原（HLA），在S3中的表达水平均高于其他三种亚型。根据泛癌种的免疫特征，S2中滤泡辅助T细胞、Th2细胞含量最高，而S3中树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞含量最高（图3B）。作者还分别评估了四种分子亚型中的免疫评分、基质评分，以及与适应性免疫和先天免疫相关的免疫细胞类型的总体评分，发现S3中所有四项评分均最高。这些结果表明S3具有更高的免疫原性，更容易被免疫系统识别并引发免疫反应。

图3. GBM亚型中的免疫相关评分和免疫细胞评分

4、特异性癌症易感性与基因表达验证

首先使用亚型特异性标记基因对CCLE中的胶质瘤细胞系进行分型。由于高级别胶质瘤细胞系数量较少，最终只映射出三个亚型：S2(n=4)，S3(n=36)，S4(n=6)。作者筛选了本研究中鉴定出的GBM体细胞拷贝数变异基因。其中，具有亚型特异性癌症易感性的基因需满足两个条件。最终发现只有2个基因（CDAN1和UBE2M）符合上述条件。但由于样本量小，这些基因的差异不显著。为了验证CDAN1和UBE2M，作者基于qRT-PCR检测了这两个基因在GBM细胞系U87中的mRNA表达水平。作者观察到与正常对照细胞相比，GBM细胞中CDAN1和UBE2M的mRNA表达水平显著上调。这些结果间接证实了作者所识别的GBM亚型的有效性。

5、蛋白质组学揭示特异性蛋白调控

为了进一步探究四种GBM亚型在蛋白表达水平上的特征，作者基于S1-4的标记基因将CPTAC中的GBM样本聚类为S1 (N=15), S2 (N=18)，S3 (N=35)和S4 (N=21)。与TCGA中的ssGSEA结果一致，CPTAC中的S2和S4亚型表现出高增殖特征，S3亚型表现出高免疫特征，这也加深了研究者对S3可能是免疫浸润型的推测（图4A）。由于S1中没有显著激活的通路，后续研究聚焦于S2、S3和S4中的蛋白调控。

GISTIC结果显示，EGFR和CDKN2A在S2、S3和S4中存在SCNA现象。具体来说，CDKN2A有更多的CNV缺失，而EGFR则有更多的扩增（图4B）。然后作者比较了EGFR和CDKN2A的蛋白丰度，发现CDKN2A的蛋白丰度在S2和S3中较高，但在S4中较低。EGFR的蛋白丰度在S2和S3中较低，但在S4中较高（图4C）。基于这些结果，作者推测S4中CDKN2A的CNV缺失和EGFR的CNV获得可能是导致CDKN2A表达降低和EGFR表达增加的主要原因之一。

图4. CPTAC GBM中的蛋白质组学数据分析

最初的GSVA结果表明S2和S4亚型具有高增殖特征，S3具有高免疫特征。为了进一步研究潜在的生物学差异，研究者在蛋白质组水平上进行了更深入的研究。CPTAC队列中，PD-L1的CNV缺失在S3和S4中更常见，但PD-L1的CNV扩增在S2中更常见。研究者还注意到S3中PD-L1的表达和磷酸化水平最高（图5A）。在S2-S4中，EGFR的CNV获得在S4中最高，CNV缺失在S2中最高，S3中则介于两者之间；并且，S4中观察到最高水平的EGFR表达、蛋白丰度和磷酸化（图5B）。在TCGA队列中，PD-L1在S2-S4中的CNV现象与EGFR大不相同。S2中PD-L1的CNV率较低，S4中几乎全是CNV缺失。S4中EGFR的CNV率高于S2和S3，且各亚型的CNV模式均为CNV获得。S2的PD-L1和EGFR表达水平最低，S3的PD-L1表达水平最高，S4的EGFR表达水平最高（图5C）。基于先前的研究，作者比较了S1-4中增殖评分和T细胞效应分子（IFN-γ反应）的表达模式。在S2和S4中观察到高水平的增殖评分，而在S2中观察到最低的IFN-γ反应评分（图5D）。S3中也观察到最高的PRF1、GZMA蛋白丰度（图5E）。因此，S2、S3和S4在免疫分子的基因组特征上存在异质性，这可能导致它们对免疫治疗的不同反应。

图5. CPTAC GBM队列中的基因组和蛋白质组学分析

6、S3是免疫检查点治疗反应的潜在分子亚型

从GEO数据库中检索到了一个接受免疫治疗的GBM测序队列GSE84010。基于标记基因的表达矩阵，样本可分为S1、S2、S3和S4。GSEA结果与TCGA队列中的样本特征趋势一致，S2和S4表现出高增殖特性，S3表现出高免疫特性（图6A）。与Verhaak等人鉴定的亚型相比，S2中的大多数病例属于前神经元亚型，S3中的大多数病例属于间质亚型，S4中的大多数病例属于经典型亚型（图6B）。这些结果与TCGA队列高度一致，进一步表明本研究中GBM的新型亚型是稳健的。为了识别对免疫治疗有反应的亚型，进行了TIDE评分分析。由于S1缺乏显著激活的通路和典型的分子分型特征，作者重点关注S2、S3和S4的免疫治疗反应。S4中的样本TIDE评分最高，表明对免疫治疗最不敏感（图6C）。S4中免疫治疗反应百分比最低也得到了验证（图6D）。相比之下，S3中的TIDE评分较低，表明从免疫治疗中获益更大（图6C, D）。这些结果表明S3亚型可能是指示GBM免疫治疗反应的关键分子亚型。由于S4的免疫治疗反应率最低，作者在放疗/替莫唑胺治疗基础上联合贝伐珠单抗治疗的GBM队列（GSE84010数据集）中，分析了四种亚型在去除无法分型的样本后的生存差异。研究者发现，在贝伐珠单抗组中，S4的预后明显优于其他三种亚型，而在安慰剂组中，四种亚型的预后无显著差异，这表明S4是最适合贝伐珠单抗的亚型。

图6.免疫治疗反应预测

7、识别亚型的生物标志物

研究结果证实了基于BayesNMF的方法构建GBM新型亚型分类是可行的。但由于这种分析方法在所有四种亚型中识别出超过400个标记基因，模型中的标记基因需要压缩。基于S2、S3和S4中的标记基因或标记蛋白，作者在TCGA-GBM队列和RPPA队列中构建了LASSO逻辑回归模型，通过选择最小lambda值来选取预测误差率最小的模型，以预测S2、S3和S4亚型。在TCGA-GBM队列中：包含13个基因的LASSO逻辑回归模型预测S2亚型的准确率达到96.7%。包含17个基因的模型预测S3亚型的准确率达到86.7%。包含14个基因的模型预测S4亚型的准确率达到93.3%。在RPPA队列中：包含17个标记蛋白的LASSO逻辑回归模型预测S2亚型的准确率达到84.6%。包含18个标记蛋白的模型预测S4亚型的准确率达到84.6%（原文表1）。这些结果表明，可以使用标记基因表达数据或蛋白表达数据准确预测S2、S3和S4亚型。

在本研究中，作者确定了GBM的四种新型分子亚型：S1、S2、S3和S4。S1：以神经元和经典型亚型为主，代谢活跃但增殖活性非常低。S2：大多数病例属于前神经元亚型，富集IDH1突变、TP53突变和缺失。S3：大多数病例属于间质亚型，观察到树突状细胞、单核细胞和中性粒细胞的高丰度，形成了一个促免疫的活性环境。S4：大多数病例属于经典型亚型，检测到高水平的EGFR表达和CNV扩增，表现出更高的增殖特征。其中，S3是四种亚型中免疫能力最强的亚型，表现出高强度的巨噬细胞调节、淋巴细胞浸润特征评分和IFN-γ反应。

有趣的是，S1的TIDE评分最低，免疫治疗反应最高。在研究中，S1没有显著激活的生物学通路，并表现出低增殖特性，这可能解释了其对免疫治疗的高反应性。研究存在一些局限性，例如队列人群主要为白人数据、需通过单细胞测序技术解析瘤内异质性等。

总之，该研究报道了一种新的GBM分型，将GBM分为四种亚型，每种亚型都有其特定的分子特征，并对免疫治疗表现出不同程度的反应率。此外，研究者还为特别重要的亚型量身定制了高精度的预测模型，为寻找亚型特异性、潜在可靶向的标记物提供了参考。

参考文献：Dongdong, Luo,Aiping, Luo,Su, Hu et al. Genomics and proteomics to determine novel molecular subtypes and predict the response to immunotherapy and the effect of bevacizumab in glioblastoma.[J] .Sci Rep, 2024, 14: 17630.

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