Cell | 用“光”控制细胞周期，让蛋白质定向进化

撰文|亦

定向进化是蛋白质工程中的重要手段，尤其连续定向进化方法因其高效性和可扩展性而备受关注【1-3】。然而，传统方法多依赖于时间不变的选择机制（如结合强度或组成型转录激活），难以适用于需要动态切换状态的蛋白质功能，如信号转导、计算型蛋白或多输入整合系统。这类蛋白质的进化需要在多个状态之间施加持续的选择压力，而现有方法往往只能交替筛选不同状态【4-5】，无法实现真正的连续进化。

近日，来自瑞士洛桑联邦理工学院物理研究所的Sahand Jamal Rahi团队在Cell上发表了题为Light-directed evolution of dynamic, multi-state, and computational protein functionalities的文章， 提出了一种名为“Optovolution”的新型连续定向进化方法，通过将光遗传学与酵母细胞周期调控相结合，实现了对动态、多状态及计算型蛋白质功能的定向进化。

为了实现对动态、多状态蛋白质功能的连续定向进化，研究团队首先明确了该方法所需的核心设计思路：目标蛋白（protein of interest ，POI）的输出 必须能够控制一个对细胞周期某一阶段必不可少、但对另一阶段有害的细胞周期调控因子，从而在细胞分裂过程中施加内在的动态选择压力 。同时，通过光遗传学手段控制POI的输入，使外部信号能够以细胞周期的时间尺度（数十分钟）进行切换。作者指出，细胞周期调控系统具有很强的鲁棒性，例如仅表达CLN2和CLB2就足以驱动细胞周期，因此需要精确筛选合适的调控节点。基于这一概念框架，他们为后续的菌株工程奠定了理论基础，即寻找一个 既对细胞周期关键又对持续表达敏感的调控因子 ，以实现光控的周期性选择。

为实现上述概念，研究团队在酿酒酵母中测试了多个光控细胞周期调控方案。 他们将El222/LOV系统控制的LIP启动子分别与CLB2、CLB2kd（不可降解型）、CDC20、CLN2和CLB5等细胞周期基因偶联，并删除相应的内源基因以使其成为必需基因。结果表明，只有LIP-CLB5能在周期性光脉冲下维持细胞存活，而在持续“开”或持续“关”光下均导致细胞死亡。为进一步增强对LIP-CLB5的依赖性，他们删除了CLB3、CLB4、CLB5、CLB6四个内源基因，并引入LIP-CLN2以提高细胞周期起始的效率，最终构建出名为“Dajbog1”的菌株。随后，通过删除SIC1（该基因可补偿细胞周期缺陷）获得更严格的“Dajbog2”菌株。此外，为便于在进化实验前维持菌株活性，他们还构建了一个“训练质粒”，并引入pol3-L523D突变以提高全局突变率。这一系列工程化改造使得 细胞周期完全依赖于光控POI的输出 ，为后续进化实验提供了严格的筛选平台 。

研究团队开展了6个定向进化实验，分别针对El222（4次）、PhyB-Pif3（1次）和PEST-rTTA（1次），并将实验流程标准化 。所有实验中， 突变频率足以在每一轮筛选中获得目标突变，证明了Optovolution的高效性和普适性 。为了验证所获突变的功能，研究团队将进化得到的POI突变体克隆回野生型酵母中，并使其驱动含PEST降解序列的荧光蛋白表达。通过荧光显微镜和Yeaz图像处理软件分析验证， 确保后续表征的可靠性，并排除Dajbog菌株基因组中其他突变对结果的影响 。

研究团队将Optovolution应用于LOV转录因子El222，开展了四个进化方向，包括3个在琼脂平板上针对不同性质进行的平行筛选和1个观察进化过程的纵向动态。 前3个方向中，第1个方向旨在提高光敏感性，第2个方向旨在降低泄漏表达，第3个方向旨在改变光谱响应，3个实验都在平板上进行，旨在获得具有特定功能的突变体。第4个方向则是在液体培养基中进行长期连续进化，目的是观察在持续选择压力下，突变如何积累、竞争和固定。第4个方向证明 Optovolution可在长期连续培养中实现多代突变竞争，并富集优势突变 。

针对PhyB-Pif3系统需外源添加phycocyanobilin（PCB）才能使用的限制，研究团队将其与GAL4BD/AD融合，控制GAL1pr驱动的CLN2和CLB5，并在Dajbog菌株中进化。 在无PCB条件下筛选出10个独立突变株，全基因组测序显示所有突变均发生在YOR1基因。进一步验证表明，删除YOR1即可使PhyB-Pif3在无PCB条件下正常响应红光，且泄漏水平与添加PCB时相当。通过删除HEM14或HMX1（胆绿素合成途径基因）发现，YOR1缺失菌株中PhyB-Pif3功能依赖于胆绿素或其衍生物，外源添加胆绿素亦可替代PCB。iRFP荧光传感器显示，YOR1缺失导致细胞内胆绿素水平升高约70%。以上说明 Yor1作为ABC转运蛋白输出胆绿素，其缺失使内源性胆绿素积累足以支持PhyB-Pif3功能 。

最后，为验证Optovolution对非光遗传蛋白的适用性，研究团队构建了一个基于PEST-rTTA（含PEST降解序列的反向四环素转录激活因子）和El222/LIP系统的AND逻辑门 。PEST-rTTA由LIP驱动，其下游tetOpr控制CLN2和CLB5。在仅给予蓝光脉冲而无doxycycline的条件下，Dajbog1细胞增殖受阻，筛选获得两个PEST-rTTA突变体（F67C和R253H）。验证实验显示，这两个突变体在doxycycline存在下显著增强tetOpr驱动的荧光表达，F67S曾被报道提高doxycycline敏感性。该结果表明， Optovolution可成功应用于非光敏蛋白的进化，拓展了其在动态、多状态及计算蛋白功能定向进化中的通用性。

综上， 作者开发了Optovolution方法，通过将目标蛋白与细胞周期调控耦合，利用光信号动态切换其输入，从而实现对动态蛋白功能的连续定向进化。 该方法不仅成功应用于LOV和PhyB-Pif3等光敏系统，还拓展至非光响应的逻辑门蛋白，填补了动态蛋白功能进化技术的空白。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.02.002

制版人： 十一

参考文献

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2. Arnold, F.H. (1998). Design by Directed Evolution.Acc. Chem. Res.31, 125–131. https://doi.org/10.1021/ar960017f .

3. Hubbard, B.P., Badran, A.H., Zuris, J.A., Guilinger, J.P., Davis, K.M., Chen, L., Tsai, S.Q., Sander, J.D., Joung, J.K., and Liu, D.R. (2015). Continuous directed evolution of DNA-binding proteins to improve TALEN specificity.Nat. Methods12, 939–942. https://doi.org/10.1038/nmeth.3515.

4. English, J.G., Olsen, R.H.J., Lansu, K., Patel, M., White, K., Cockrell, A.S., Singh, D., Strachan, R.T., Wacker, D., and Roth, B.L. (2019). VEGAS as a Platform for Facile Directed Evolution in Mammalian Cells.Cell178, 748–761.e17 .

5. Berman, C.M., Papa, L.J., Hendel, S.J., Moore, C.L., Suen, P.H., Weickhardt, A.F., Doan, N.-D., Kumar, C.M., Uil, T.G., Butty, V.L., et al. (2018). An Adaptable Platform for Directed Evolution in Human Cells.J. Am.Chem. Soc.140, 18093–18103. https://doi.org/10.1021/jacs.8b10937.

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