《食品科学》：河北农业大学田益玲教授等：甜叶菊提取物异绿原酸对过氧化氢诱导的肠上皮细胞损伤的保护作用

肠道作为机体和外界接触最为密切的器官之一，不仅是营养物质的主要消化和吸收器官，还作为一道重要的防御屏障，抵御肠腔中毒素、病原体和抗原等的入侵。目前，随着全球老龄化进程加速及亚健康人群规模不断扩大，肠道功能障碍相关问题在人群中变得越来越普遍。研究发现，氧化应激是诱发肠道屏障损伤的关键因素，可导致肠上皮细胞氧化还原失衡，活性氧（ROS）过量累积，使机体抗氧化酶活性降低和细胞膜通透性升高，从而破坏紧密连接蛋白的结构与表达，加剧细胞凋亡，最终导致肠道屏障功能障碍。然而，当前医疗体系针对肠道功能受损过度依赖抗生素等化学药物，导致肠道微生态极易失衡，耐药性增加，为肠道屏障功能障碍的治疗带来极大难度。在此背景下，大健康产业亟需转向安全可持续的天然生物活性物质研究。

多酚作为植物中常见的天然物质，具有抗氧化、抗菌、抗炎和免疫调节等作用。目前已发现绿茶多酚、葡萄多酚和苹果多酚具有降低炎症反应调节自身平衡的作用。异绿原酸（ICGA）是经植物体内有氧呼吸由莽草酸途径中咖啡酸和奎宁酸缩合形成的酚酸，具有非抗生素特性、多靶点调节能力及肠道微生态友好性等特性，广泛存在于甜叶菊、金银花、杜仲等药用植物中。ICGA属于二咖啡酰奎宁酸类化合物，以异绿原酸A(ICGA-A）、异绿原酸B(ICGA-B）和异绿原酸C(ICGA-C)3种异构体（图1）形式存在，在特定条件下3种异构体可互相转化。2025年国家卫生健康委员会1号文件发布了甜叶菊多酚作为新食品原料公告，甜叶菊多酚的生物活性将备受食品研发人员的关注。在畜禽生产中也证实，甜叶菊ICGA可调节肠道上皮细胞的增殖和凋亡，降低肠道黏膜上皮的通透性，进而缓解炎症损伤并提高畜禽生长性能。

河北农业大学食品科技学院的程文丽、田益玲*，河北农业大学生命科学学院的郭云霞*等人通过研究甜叶菊提取物中多酚和ICGA的含量，从细胞存活率、抗氧化酶活性及肠道相关基因表达等方面，探究甜叶菊提取物ICGA对H2O2诱导的小肠上皮细胞氧化损伤的保护作用，以期为ICGA在缓解肠道氧化损伤领域提供理论依据。

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甜叶菊提取物中的总多酚含量

以没食子酸标准液的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标得到标准曲线的回归方程为y=0.111 8x-0.01,R2=0.999，线性关系良好，可以用于总多酚含量的测定。在相同的条件下测定甜叶菊提取物的吸光度，通过式（1）计算出样品中总多酚含量为676.8 mg/g，占比为67.68%。

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甜叶菊提取物中的ICGA含量

以对照品3种ICGA质量浓度（x,mg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，所得回归方程和决定系数见表3。甜叶菊提取液样品高效液相色谱分析结果如图2所示，根据保留时间可以看出样品中含有ICGA 3种同分异构体，即ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C。通过将峰面积带入标准曲线计算得出，ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C在样品中的质量分数分别为20.6%、20.4%和23.2%，三者总占比达到64.23%，其中ICGA-C占比最高。ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C在样品中总多酚的占比达到了94.90%。

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H2O2诱导IPEC-J2细胞损伤

如图3所示，当H2O2浓度在100～200 μmol/L时，细胞的存活率在50%左右，当H2O2浓度大于200 μmol/L后，细胞存活率极低。细胞存活率过低时不利于模型的构建，所以只讨论H2O2浓度在100～200 μmol/L时细胞的存活情况。在此浓度范围内，细胞的存活率与作用时间无显著关系（P>0.05）。因此，初步选定100 μmol/L H2O2和200 μmol/L H2O2处理1 h作为构建细胞氧化应激模型的条件。

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H2O2诱导IPEC-J2细胞氧化应激

如图4所示，细胞经不同浓度的H2O2处理1 h后，与对照组相比，各组的M D A含量都显著上升（P<0.05），其中，200 μmol/L H2O2组显著高于100 μmol/L H2O2组（P<0.05)；CAT和GSH-Px活性都显著下降（P<0.05），且200 μmol/L H2O2组显著低于100μmol/L H2O2组（P<0.05）；各处理组SOD活性和T-AOC均显著低于对照组（P<0.05）。最终确定200 μmol/L H2O2处理细胞1 h构建氧化应激损伤模型。

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甜叶菊提取物ICGA对IPEC-J2细胞存活率的影响

如图5所示，细胞添加含不同浓度的ICGA甜叶菊提取物溶液作用12 h后与对照组相比，随着ICGA作用浓度的上升，IPEC-J2细胞存活率先上升然后下降。当作用浓度由10 μmol/L增加到50 μmol/L时，细胞存活率由99.06%增加到111.77%；当作用浓度增加到100 μmol/L时，细胞的存活率开始下降，此时存活率为97.41%；当作用浓度由100 μmol/L增加到400μmol/L时，细胞存活率持续下降至5.25%。说明一定浓度的ICGA对细胞有增殖促进作用，但浓度过大时，会对细胞产生抑制作用，导致细胞死亡。当甜叶菊提取物中ICGA的浓度在0～100 μmol/L时对细胞基本无毒性。因此确定ICGA浓度50 μmol/L和100 μmol/L、作用时间12 h用于后续实验。

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甜叶菊提取物ICGA缓解H2O2诱导的IPEC-J2细胞损伤

如图6所示，模型组的细胞存活率为77.49%，与对照组相比，显著下降了22.51%(P<0.05);ICGA预保护组中，50 μmol/L ICGA组的细胞存活率为90.23%，比模型组显著提高了16.44%(P<0.05);100 μmol/L ICGA组的细胞存活率为95.99%，比模型组显著提高了23.87%(P<0.05）。表明ICGA预保护能能显著缓解H2O2模型造成的细胞存活率下降的情况。

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甜叶菊提取物ICGA提高H2O2处理下IPEC-J2细胞的抗氧化能力

如图7所示，与模型组相比，I C G A预保护组MDA含量均显著降低（P<0.05）；对于CAT和SOD活性以及T-AOC,ICGA预保护组均显著高于模型组（P<0.05）；其中100 μmol/L ICGA组T-AOC显著高于50 μmol/L ICGA组（P<0.05）。表明ICGA能通过提高机体的抗氧化能力以及降低MDA的累积缓解H2O2诱导的氧化应激损伤。

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甜叶菊提取物ICGA提高H2O2处理下IPEC-J2细胞的紧密连接基因表达水平

如图8所示，与对照组相比，模型组显著降低了细胞中Occludin、ZO-1和Claudin-1的mRNA相对表达量（P<0.05）。与模型组相比，50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA预保护组均显著提升了细胞中Occludin和Claudin-1的m R N A相对表达量（P<0.0 5);100 μmol/L ICGA预保护组还显著提升了细胞中ZO-1的mRNA相对表达量（P<0.05）。50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA两个预保护组相比，100 μmol/L ICGA预保护组细胞中Occludin的mRNA相对表达量显著高于50 μmol/L ICGA组（P<0.05）。

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甜叶菊提取物ICGA降低H2O2处理下IPEC-J2细胞凋亡相关基因的表达水平

如图9所示，与对照组相比，模型组显著降低了细胞中Bcl-2的mRNA相对表达量（P<0.05），显著提升了细胞中Caspase-3的mRNA相对表达量（P<0.05）。与模型组相比，100 μmol/L ICGA预保护组显著提升了细胞中Bcl-2的mRNA相对表达量（P<0.05),50 μmol/L ICGA组和100 μmol/L ICGA预保护组均显著降低了细胞中Caspase-3的mRNA相对表达量（P<0.05）。50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA两个预保护组相比，100 μmol/L ICGA预保护组Bcl-2的mRNA相对表达量显著高于50 μmol/L ICGA组（P<0.05），而Caspase-3的mRNA相对表达量显著低于50 μmol/L ICGA组（P<0.05）。

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结 论

甜叶菊不仅是天然的甜味剂和降糖成分，其提取物还具备抗菌防腐、心血管调节、抗炎免疫和代谢调控等多重功效，而甜叶菊多酚是从甜叶菊叶片中提取的多酚类化合物，主要含绿原酸衍生物和黄酮等活性成分，因其显著的抗氧化、抗菌和抗炎特性，在食品工业中广泛应用，2025年我国已正式批准其为新食品原料。与其他植物（金银花、咖啡豆、杜仲）对比，甜叶菊中的ICGA含量明显较高，且相较于绿原酸，多一个咖啡酰基团的ICGA表现出更强的抗炎、抑菌、抗氧化、抗病毒活性。ICGA以A、B、C 3种同分异构体的形式在植物体中存在，但3种异构体在溶液中极不稳定，在一定条件下可发生相互转化。Park的研究表明，这3种ICGA同分异构体均能有效抑制H2O2诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的凋亡。Iwai等指出，在ICGA中相较于另外2种同分异构体，ICGA-C的抗氧化活性最强，推测这可能是由于其结构中的两个咖啡酰基团间距最远，空间位阻较小，使得邻二酚羟基得以更充分地暴露，从而更有效地与自由基反应或与酶的活性位点结合。本实验中发现，甜叶菊提取物中总多酚占比67.68%，其中包含ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C 3种同分异构体，其质量分数分别为20.6%、20.4%和23.2%，三者总质量分数达到64.23%,ICGA-C相对含量最多，ICGA的含量占总多酚含量的94.90%，这也是甜叶菊提取物具有抗氧化功能的关键。ICGA类物质能激活核因子E2相关因子2(Nrf2）等抗氧化信号通路，增强细胞内源性抗氧化酶的表达，减轻氧化损伤，又能抑制核因子κB(NF-κB）等经典炎症信号通路的过度活化，降低促炎因子的水平，直接缓解炎症。

IPEC-J2细胞是一种从新生仔猪空肠中分离的非转化型肠上皮细胞系，因其源于正常小肠组织且保留未转化特性，相比其他常用模型更能代表生理状态的肠道环境，被广泛用于肠道屏障功能及氧化应激等方面的研究。H 2 O 2 可诱导细胞产生过量的ROS，过量ROS产生和自由基的形成会导致氧化应激，从而损伤细胞、组织和器官，此时，除了细胞的存活率发生变化外，CAT、SOD、GSH-Px活性、T-AOC以及MDA含量也会发生相应的变化，同时也是判断细胞是否受到氧化应激的重要依据。金鹿等基于奶牛乳腺上皮细胞的细胞活性及抗氧化指标筛选确定600 μmol/L H 2 O 2 处理6 h为最佳建模条件。孙婧陶等通过延边奶山羊乳腺上皮细胞的活性、凋亡状态及ROS水平综合评估发现100μmol/L H 2 O 2 处理4 h即可有效建立氧化损伤模型。由此可见，细胞类型、培养微环境参数等的不同，均可能导致其构建氧化损伤模型的作用时间和浓度存在显著差异。研究者通常将半数细胞存活率对应的处理参数作为核心优化指数。如果细胞存活率过高，表明细胞没有受到明显的损伤，不利于进行后续实验；存活率过低，细胞大量死亡造成不可逆的损伤，亦不利于后续实验的进行。本实验以IPEC-J2细胞的存活率达50%左右为标准，对H 2 O 2 作用浓度及作用时间进行初步筛选。结果发现，当100 μmol/L H 2 O 2 和200 μmol/L H 2 O 2 作用细胞1 h时的细胞存活率分别为67.31%和50.86%，此时并没有造成细胞大量死亡，还有进行自我修复的可能性。结合抗氧化指标检测发现IPEC-J2细胞经100 μmol/L和200 μmol/L H 2 O 2 处理1 h后均显著降低了CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC，显著提高了MDA含量，且200 μmol/L H 2 O 2 对IPEC-J2产生的氧化应激效果更好。因此，最终将200 μmol/L H 2 O 2 处理1 h作为IPEC-J2细胞氧化应激损伤的条件。

在抗氧化系统中的酶是体内抗氧化的重要途径之一，其中SOD可将ROS通过歧化反应生成H 2 O 2 ，H 2 O 2 在CAT的作用下被分解为水和氧气，从而缓解机体氧化损伤。甜叶菊提取物可通过降低巨噬细胞产生一氧化氮，显著提高SOD活性并降低MDA含量，减轻机体自由基损伤，进而缓解脂多糖诱导的巨噬细胞氧化应激。ICGA的抗氧化活性可能既源于其分子结构中的酚羟基直接清除ROS（如羟自由基和超氧阴离子自由基），又通过激活Nrf2信号通路调控下游基因表达，显著增强机体抗氧化酶活性并减少MDA的积累，从而共同保护组织免受氧化损伤。在小反刍兽疫病毒感染非洲绿猴肾Vero细胞中，焦豪杰也发现，ICGA-A能提高SOD活性，降低ROS含量和MDA含量，进而缓解病毒感染导致的宿主细胞氧化应激损伤，提高宿主细胞活力。本实验结果表明，50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA处理氧化应激模型后，细胞存活率比模型组显著提高了16.44%和23.87%，50 μmol/L和100 μmol/L ICGA处理均显著提高了CAT、SOD活性和T-AOC，显著降低了MDA含量，且100 μmol/L ICGA预处理组T-AOC显著高于50 μmol/L ICGA组，表明甜叶菊提取物ICGA能够缓解H 2 O 2 诱导的IPEC-J2细胞氧化应激损伤，提高细胞增殖能力。

紧密连接是肠道屏障的核心结构，主要由跨膜蛋白Occludin、Claudins家族及外周膜蛋白ZO家族等共同构成。Occludin通过磷酸化控制ZO-1蛋白，进而调节紧密连接的稳定性和通透性，ZO蛋白充当桥梁，将Occludin和Claudin等连接蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架，这些蛋白相互作用维持紧密连接的形成和功能。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者而Bcl-2是抗凋亡蛋白家族的核心成员。本实验中，经过H 2 O 2 诱导后，与对照组相比，模型组细胞中Claudin-1、ZO-1、Occludin和Bcl-2的mRNA相对表达量均显著降低，Caspase-3的mRNA相对表达量显著上升，这与Zhong Yajing等的报道一致，表明H 2 O 2 能够通过造成氧化应激破坏肠道形态的完整性，增加肠道通透性，影响肠道的正常功能。ICGA在幼畜日粮中添加可改善小肠绒毛形态结构，促进肠道Occludin和ZO-1基因的表达，增强肠道机械屏障功能。在对阿尔茨海默病的干预实验中发现ICGA-A可激活表皮生长因子受体/Ras/细胞外信号调节激酶信号通路，显著提高细胞活力，逆转损伤组促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA和蛋白水平升高的同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白水平。本研究发现，细胞经过ICGA预处理后，能够显著缓解H 2 O 2 引起的Occludin和Claudin-3的mRNA相对表达量的下降，显著缓解Caspase-3的mRNA相对表达量的上升；其中100 μmol/L ICGA预处理组还能显著缓解ZO-1和Bcl-2的mRNA相对表达量下降，这可能与ICGA通过激活Nrf2抗氧化通路增强Bcl-2的转录和提高抗凋亡蛋白水平，同时通过抑制NF-κB信号通路减少促炎因子的释放，从而阻断Caspase-3上游激活信号，从而降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达有关。

综上，含100 μmol/L ICGA的甜叶菊提取物可通过提高抗氧化酶CAT、SOD的活性和T-AOC，降低MDA累积，且上调肠上皮细胞的紧密连接基因Occludin、ZO-1和Claudin-1的mRNA和抗凋亡Bcl-2相对表达量，下调促凋亡Caspase-3相对表达量，进而缓解H 2 O 2 引起的肠上皮细胞的氧化应激损伤，为开发安全可持续的天然生物活性物质以缓解现代生活中人体日益加剧的氧化应激负荷现象提供了理论支撑。

引文格式：

程文丽，郝庆红，袁宇婷，赵鹏宇，钱周泽，郭云霞，田益玲. 甜叶菊提取物异绿原酸对过氧化氢诱导的肠上皮细胞损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2025, 46(23): 215-224.

CHENG Wenli, HAO Qinghong, YUAN Yuting, et al. Protective effect of isochlorogenic acid extracted from Stevia rebaudiana against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury[J]. Food Science, 2025, 46(23): 215-224.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250624-164.

实习编辑：李杭生；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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