FSHW | 咸蛋清衍生肽通过抑制NF-κB/MAPK/PI3K-AKT信号通路和调节肠道微生物群组成，改善DSS诱导小鼠结肠炎

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Introduction

IBD已经成为对人类健康最危险的慢性疾病之一，伴随着反复的炎症并且无法治愈，以克罗恩病和溃疡性结肠炎2 种主要的形式存在。通常表现为结肠炎症、溃疡、体重减轻、便血等症状。尽管UC的病因和发病机制尚不清楚，但是研究表明这似乎与环境、饮食和遗传易感性等有关。

在缓解UC的策略中，通过作用于炎症通路对抗炎症反应是已经被关注到的一种思路。在炎症发生时，NF-κB,MAPK,JAK/STAT等炎症通路信号通路被激活，进而导致大量的促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等积累，造成发炎的靶组织损伤，在UC的病理中发挥重要作用。因此，阻断炎症通路的表达进而缓解肠道炎症是一种有效的策略。另一方面，通过调节肠道菌群缓解UC逐渐成为研究的热点。肠道微生物群是一个复杂的生态系统，在维持免疫系统稳态方面发挥着重要作用。

一些天然活性成分如多酚、多糖和多肽等，已被证明对免疫反应、肠道屏障功能和肠道微生物群之间的相互作用都有积极影响，并且对进一步改善结肠炎症状有显著的效果。其中，蛋清中含有多种优质的蛋白质，具有抗炎抗氧化、抗菌等多种生物活性。咸蛋清是由鸭蛋经高盐腌制后获得，含有与新鲜鸭蛋相当的丰富蛋白质，也具有很多活性物质。然而咸蛋清在工业生产中一直未能得到良好的利用，因此，探究咸蛋清的活性功能，对赋予其一定的利用价值具有重要意义。

江西农业大学食品科学与工程学院硕士周娜、江西农业大学食品科学与工程学院涂勇刚教授等在本文中以咸蛋清中的活性肽为研究对象，探究了其对肠道炎症的缓解作用。

图1 图文摘要

缓解DSS诱导的结肠炎小鼠症状

文章通过DSS喂养模拟小鼠肠道炎症，DSS诱导后小鼠的体重比诱导前下降了9.34%，在最后一天比对照组下降了14.4%。口服VF-4和DR-8（50和150 mg/kg）改善了DSS诱导的小鼠体重减轻。实验组小鼠的体重变化小于DSS组，但各组对体重减轻的影响并不显著。同时，用DSS诱导的小鼠出现腹泻和便血，导致DAI评分很高。然而，用VF-4和DR-8治疗的小鼠显示出这些症状的改善，疾病严重程度降低，结肠炎的临床症状减少。DSS诱导后，DSS组小鼠出现充血、水肿和溃疡，其结肠长度显著缩短，口服VF-4和DR-8后，结肠缩短明显改善。结肠长度恢复到1 cm以上，结肠指数恢复。我们还观察到DSS导致小鼠脾脏肥大，DSS组小鼠的脾脏与对照组相比显著增大。口服两种浓度的VF-4和高浓度的DR-8显著降低了小鼠的脾脏重量，并与对照组相似。

图2 VF-4和DR-8对DSS诱导的小鼠结肠炎症状的影响

咸蛋清肽（VF-4和DR-8）改善DSS诱导的小鼠结肠组织损伤

DSS诱导可导致肠组织结构严重异常，包括杯状细胞丢失、隐窝几乎完全消失、黏膜上皮细胞部分脱落、固有层暴露、黏膜下水肿、大量炎性细胞浸润和纤维组织增生。然而，摄入VF-4和DR-8后，这些情况得到了显著改善，杯状细胞（红色箭头）和隐窝（黑色箭头）的数量明显高于DSS组，炎性细胞浸润较少（黄色箭头），黏膜损伤轻微（蓝色箭头）。尽管没有明显的剂量依赖性，但VF-4和DR-8治疗的浓度都减轻了DSS诱导的结肠炎，降低了组织学评分，并证实了VF-4和DR-8对结肠炎的有益预防作用。

图3 VF-4和DR-8对结肠炎小鼠结肠组织学变化的影响

VF-4和DR-8抑制DSS诱导的结肠炎小鼠细胞因子表达

如图所示，DSS组小鼠结肠中IL-6和TNF-α的分泌明显高于对照组。然而，VF-4和DR-8治疗组的TNF-α分泌显著降低。高浓度组的抑制效果明显优于低浓度组，尽管两种肽之间没有显著差异。同时，VF-4和高浓度DR-8均显著抑制IL-6的分泌。此外，通过qPCR检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和INF-γ的基因表达。如图4B所示，DSS组结肠中促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ）的mRNA表达显著上调，口服50或150 mg/kg VF-4和DR-8显著降低了这些促炎细胞素的表达。

图4 VF-4和DR-8对结肠细胞因子的影响

VF-4和DR-8抑制PI3K-Akt/NF-κB/MAPK信号传导的激活

如图5所示，DSS组小鼠结肠中PI3K-Akt通路被激活，磷酸化Akt的表达显著增加，而Akt和PI3K的表达显著降低。摄入50和150 mg/kg的VF-4和DR-8显著抑制了磷酸化Akt的表达，导致p-Akt/Akt比值降低。此外，它还抑制了PI3K的降解。同样，DSS在小鼠结肠中激活NF-κB信号后，2 种剂量的VF-4和DR-8均显著抑制了NF-κB磷酸化抑制剂（IκB）和P65的表达，并降低了κB激酶抑制剂（IKK）、IκB和P65蛋白的降解。与对照组相比，DSS激活MAPK通路显著增加了p-细胞外调节蛋白激酶（ERK）/ERK、p-c-Jun N-末端激酶（JNK）/JNK和p-p38/p38的值（P < 0.05）。两种浓度的VF-4都能显著抑制JNK和P38的磷酸化表达，但仅在高浓度（150 mg/kg）下抑制ERK的磷酸化。50和150 mg/kg的DR-8均能显著抑制ERK、JNK和P38的磷酸化，与对照组相比，抑制作用没有显著差异。

图5 VF-4和DR-8对结肠炎症中信号通路的影响

肠道微生物群组成的变化

通过测序和鉴定，从16 个样本中获得了118 742 个CCS序列。经过过滤去除低质量序列后，在97%的相似性水平上获得了总共324 个分类操作单元（OTU）。肠道微生物群多样性分析包括α多样性和β多样性，用于反映微生物的物种丰度、多样性和相似性。如图6A-D所示，DSS诱导后，小鼠的Chao1指数和Ace指数均有不同程度的降低，表明DSS降低了小鼠肠道菌群的丰度。然而，DSS处理增加了Shannon指数和Simpson指数，而样品处理降低了该值，表明样品处理减少了DSS引起的微生物多样性变化。主坐标分析（PCoA）可视化了不同群体之间的微生物群落组成集群。DSS处理的小鼠和对照组之间的群落距离存在显著差异，表明DSS改变了小鼠肠道菌群的结构。同时，实验组样本的分布也与DSS组相对分离，表明VF-4和DR-8也对DSS诱导的结肠炎小鼠中微生物的丰度和多样性具有调节作用。

图6 VF-4和DR-8对结肠炎小鼠肠道微生物群多样性的影响

肠道微生物群的物种组成和丰富度

根据测序分类注释的结果，分析了对照组、DSS组、VF-4组和DR-8组在门和属水平上的肠道菌群变化。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门是肠道中的优势菌群，占比最大（总数的96.03%），其次是Epsilonbacteraeota和脱Deferribacteres，如图7A所示。Firmicutes（F）与Bacteroidetes（B）的比例通常是评估微生物变化的重要指标。在我们的研究结果中，DSS组的F/B比值（1.76）低于对照组（F/B 2.02）。VF-4组的F/B比为2.16，DR-8组为1.12。这表明这两种肽对细菌群落的调节作用不同，这可能与它们的氨基酸序列有关。同时，DSS组中的Epsilonbacterota门和Deferribacteres门分别增加了7.82%和4.37%，表明DSS改变了微生物组成。基于DSS诱导，VF-4和DR-8的摄入改变了物种丰富度。在VF-4组中，Firmicutes的丰度增加，Deferribacteres的丰度减少。在DR-8组中，Bacteroidetes的丰度增加，Proteobacteria的丰度减少。在属水平上，与对照组相比，DSS组主要上调了有害细菌的丰度，包括拟Bacteroides、Lachnospiraceae_NK4A136_ group和Mucispirillum。降低了有益细菌（如Lactobacillus）的丰度。然而，VF-4和DR-8治疗组逆转了DSS诱导的菌群变化，主要包括下调有害细菌，如Acinetobacter, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Ruminiclostridium_6, Klebsiella，并上调有益细菌的相对丰度，如Lactobacillus和Blautia。此外，VF-4治疗还降低了[Eubacterium]_fissicatena_group 和Bacteroides的相对丰度，DR-8治疗降低Firmicutes，它们之间的相似性如图7D所示。

图7 微生物组成

LEfSe分析

通过线性判别分析（LDA）和效应大小（LEfSe）分析每组中的优势菌群，以确定肠道微生物对VF-4和DR-8的结构变化。如图8所示，在DSS组中，Klebsiella, Ruminiclostridium_6和Lachnospiraceae_UCG_006是优势属。VF-4组的优势菌为Clostridium, Blautia, Bacteroides_thetaiotaomicrom, Helicobacter_typhlomius。在DR-8组中，优势菌为Bacteroides sartorii, Parabacteroides_goldsteinii, Helicobacter, 和Eubacterium-fissicatena group。

图8 微生物群的LEfSe分析

促炎细胞因子与主要微生物群的相关性

冗余分析（RDA）/典型对应分析（CCA）主要用于反映细菌群落或样本与环境因素之间的关系，这是一种基于对应分析开发的排名方法。根据物种分布的变化，选择最佳分析模型来确定TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ促炎细胞因子与微生物群组成之间的关系。如图9A所示，这4 种促炎细胞因子与DSS组的肠道菌群呈正相关，与其他组的肠菌群呈负相关。4 种促炎细胞因子相互呈正相关，与肠道微生物组显著相关，相关程度为IL-6>TNF-α>IL-1β>IFN-γ。然后使用Spearman算法进行相关性分析和统计检验，筛选相关性大于0.5且P值小于0.05的数据组。基于Python绘制了相关热图，如图9B所示。Acinetobacter, uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Ruminiclostridium_6, Klebsiella,[Eubacterium]_fissicatena_group, Mucispirillum均与TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ呈正相关，在某些属中具有显著性。Lactobacillus与TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ呈负相关，而Blautia与IL-1β和TNF-α呈负相关。

图9 促炎细胞因子基因表达与属水平微生物群的相关性分析

结论

综上所述，本研究表明VF-4和DR-8是具有预防UC抗炎潜力的肽。一方面，VF-4和DR-8通过抑制NF-κB/MAPK/PI3K-Akt信号通路的激活和下调促炎细胞因子的基因表达来减轻炎症。另一方面，他们调节肠道菌群，降低有害细菌的丰度，增加益生菌的相对丰度，以维持肠道健康。因此，从咸蛋清中提取的肽VF-4和DR-8可被视为治疗肠道炎症的新策略，进一步的研究应侧重于探索该肽的体内生物利用度及其机制。

作者简介

第一作者

周娜，女，农学硕士，主要研究方向为生物活性物质对肠道炎症的作用机制，以第一作者身份发表SCI论文4 篇。

通信作者

涂勇刚，男，江西农业大学食品科学与工程学院院长，教授，加拿大圭尔夫大学博士后，博士研究生导师，江西省“井冈学者”特聘教授，先后主持国家自然科学基金项目5 项，江西省杰出青年基金项目、江西省自然科学基金重点项目、江西省重点研发计划重点项目等省部级项目11 项，曾在Trends in Food Science & Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Food Hydrocolloids、Food Chemistry、Journal of Agricultural and Food Chemistry等国内外食品科学领域杂志上发表SCI/EI论文90余篇，其中一区TOP论文50余篇。

Salted egg white derived-peptides VF-4 and DR-8 improve DSS-induced colitis in mice by inhibiting NF-κB/MAPK/PI3K-AKT signaling pathways and modulating gut microbiota composition

Na Zhoua,b,c, Na Wua,b,c, Yao Yaoa,b,c, Shuping Chena,b,c, Mingsheng Xua,b,c, Zhongping Yina,b,c, Yan Zhaoa,b,c, Yonggang Tua,b,c,*

a Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China

b Agricultural Products Processing and Quality Control Engineering Laboratory of Jiangxi, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China

c Jiangxi Experimental Teaching Demonstration Center of Agricultural Products Storage and Processing Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China

*Corresponding author.

Abstract

Inflammation underlies many chronic diseases, and inflammatory bowel disease (IBD) is a condition characterized by long-term inflammation of the gut. Egg whites have been shown to contain many beneficial active substances. Therefore, we obtained 2 peptides from salted egg white: Val-Val-His-Phe (VF-4) and Asp-Thr-Gln-Ala-Met-Pro-Phe-Arg (DR-8). The sodium dextran sulfate (DSS)-induced mice colitis model was used to evaluate its regulatory effect on colitis in vivo. The results showed that VF-4 and DR-8 improved the clinical symptoms of DSS-induced colitis, attenuated colon tissue damage, inhibited the activation of nuclear factor kappa-B (NF-‍κB)/mitogen-activated protein kinase (MAPK)/phosphoinositide 3-kinase-Akt (PI3K-AKT) signaling pathways, and inhibited the expression of inflammatory cytokines. 16S rRNA gene sequencing showed that VF-4 and DR-8 administration increased the relative abundance of intestinal beneficial bacteria including Lactobacillus, Blautia, and down-regulated the relative abundance of inflammation-related bacteria including Acinetobacter, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Klebsiella. Moreover, the degree of correlation between pro-inflammatory cytokines and microbiota was as follows: interleukin-6 (IL-6) > tumor necrosis factor-α (TNF-α) > interleukin-1β (IL-1β) > interferon-γ (IFN-γ). In conclusion, this study suggests that salted egg white peptides VF-4 and DR-8 have a significant anti-inflammatory effect in vivo. It also provides a strategy for the treatment of IBD and a new way for the high-value utilization of salted egg white.

Reference:

ZHOU N, WU N, YAO Y, et al. Salted egg white derived-peptides VF-4 and DR-8 improve DSS-induced colitis in mice by inhibiting NF-κB/MAPK/PI3K-AKT signaling pathways and modulating gut microbiota composition[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(6): 9250136. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250136.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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