《食品科学》：枣庄学院王照鹏博士等：利用时间分辨荧光免疫层析法测定调味品中的罗丹明B

罗丹明B（RB）是一种人工合成染料，常用于纺织业、制药工业和生物分析化学领域。RB对人和动物的致癌性、生殖发育毒性、神经毒性和慢性毒性已被许多研究证明。然而，由于RB具有鲜艳的颜色特性和较强的染色稳定性，且价格便宜，一些不法商家为了增强和保持食品外观，吸引消费者，将其非法用于食品中，特别是辣椒粉、辣椒油、酱料等中，给消费者的饮食安全带来了极大的风险。

近年来，一些新的纳米材料如荧光微球、量子点，时间分辨荧光微球等逐步应用到免疫层析法中，以提高其检测灵敏度，其中时间分辨荧光微球是含有大量镧系荧光材料的功能微球，具有荧光强度大、寿命长、斯托克斯位移大等独特光学性质，能有效消除基质中各种背景荧光干扰，与胶体金、普通荧光微球和量子点荧光免疫层析法相比，时间分辨荧光免疫层析（TRFICA）法具有检出限（LOD）低、线性范围宽、抗原及抗体用量少、检测时间短等优势，目前已成为食品中有害小分子化合物定量分析的一个焦点研究方向，并被广泛报道，然而其能否应用于RB的检测目前鲜见相关报道。RB是一种荧光物质，在水溶液中最大发射波长为576 nm，但其荧光寿命极短，不到3 ns，而时间分辨荧光信号的收集时间范围是400～800 μs，在此范围内RB产生的荧光已完全衰减，因此，采用TRFICA实现对RB的检测在理论上是可行的。

枣庄学院食品科学与制药工程学院的王照鹏*、 高馨妍、刘潇晴 等人结合时间分辨荧光标记技术和侧流免疫层析技术，初步探讨TRFICA应用于RB检测的可行性。通过优化荧光探针的标记条件、试纸条包被和反应条件、样品预处理等，建立调味品中RB的TRFICA方法，旨在为食品中非食用色素的监管提供新的检测工具。

1

TRFICA检测机理

本实验所构建方法基于竞争性免疫分析原理，样品溶液中的RB与NC膜上包被的RB-BSA抗原竞争结合探针抗体。如图2所示，将标记好的探针和样品溶液加入到微孔中，孵育后用试纸条进行检测，当样品溶液无RB时，探针被T线包被的RB-BSA抗原捕获，在紫外光下可形成明亮的荧光线，此时为阴性；若样品溶液含有RB时，则与T线上的RB-BSA抗原竞争探针，减少探针与RB-BSA抗原的结合，导致T线的荧光减弱或消失，此时为阳性。样品溶液中RB越多，T线处的荧光强度越弱。无论样品中是否含有RB，探针均会与C线预先包被的二抗结合，在紫外光下出现一条荧光线，即质控线。

2

试纸条反应条件的优化

影响抗原抗体反应的因素包括抗原和抗体浓度、反应pH值、反应时间等，本研究采用单因素分析法对抗原包被量、探针抗体标记量、试纸条反应pH值等试纸条反应条件进行优化。

NC膜上的包被抗原与样品中目标物分子竞争结合荧光探针上的抗体，抗原包被量过多将抑制探针抗体和样品中目标物的结合，产生低灵敏度信号。选择1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL 4 个RB-BSA抗原质量浓度进行优化，如图3a所示，试纸条包被抗原质量浓度越高，虽然T线荧光强度有所增强，但抑制率也随之升高，当抗原质量浓度为1.0 mg/mL时，抑制率最低，故作为最佳抗原包被量。

探针抗体标记量能显著影响检测试纸条荧光信号强度和抑制率。抗体标记量过大将使荧光探针上抗体过饱和，需要更高浓度的RB才能抑制探针和T线抗原的结合，造成检测灵敏度下降。选择anti-RB mAb标记量（anti-RB mAb与荧光微球料液比）分别为0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，如图3b所示，当抗体标记量越大，试纸条T线荧光强度越强，抑制率出现先降低后升高的趋势。当抗体标记量为0.4 mg/mL荧光微球时，抑制率最低，故作为荧光微球最佳抗体标记量。

pH值可诱导抗体分子发生显著的构象变化，这可能破坏与抗原的互补性，影响抗原抗体结合。对样品稀释液的pH值进行优化，如图3c所示，试纸条在不同pH值条件下T线荧光强度和抑制率均出现明显差异，当pH值为7.4时，试纸条抑制率最低，故确定的试纸条反应的最佳pH值为7.4。

表面活性剂在侧流免疫层析中能降低表面张力，促进侧向流动过程，并促进免疫探针在试纸条上的扩散，减少非特异性吸附，进而影响试纸条显色和抑制率。本实验比较了吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100和S9 4 种表面活性剂对试纸条T线显色和抑制率的影响，如图3d所示，当使用曲拉通X-100和S9作为表面活性剂时，试纸条T线显色较弱且抑制较差，当使用吐温-20和吐温-80时，两者荧光强度相当，但吐温-20抑制率更低，故选择吐温-20作为试纸条反应最佳表面活性剂。

有机溶剂浓度过高可降低抗体生物活性，影响与抗原的结合。因样品预处理使用的提取剂为体积分数40%乙醇溶液，故需确定试纸条的最高乙醇耐受量，以确定样品提取液的稀释倍数。如图3e所示，当乙醇体积分数为5%～20%时，试纸条的T线显色和抑制率相差不明显，当乙醇体积分数达到30%时，试纸条显色明显变弱，探针在NC膜底端出现明显聚集，推测过高的乙醇含量可能影响了探针在NC膜上的迁移，并影响了探针和抗原的结合，造成试纸条显色减弱和抑制率升高。虽然试纸条最高可耐受体积分数20%乙醇溶液，但乙醇体积分数为10%时，抑制率相对更低，故选择体积分数10%乙醇溶液作为试纸条反应的最佳乙醇耐受量。

荧光探针用量能显著影响试纸条T线荧光强度，使T/C值改变，进而影响抑制率。如图3f所示，随着荧光探针用量的增加，试纸条T线荧光强度逐渐增强，抑制率出现先升高后降低的趋势。当荧光探针用量为4 μL时，抑制率最低，故选择4 μL作为试纸条反应的最佳探针用量。

3

试纸条层析时间的确定

试纸条层析时间过短情况下，反应难以达到平衡，影响检测准确性，层析时间过长，则会降低检测效率。如图4所示，随着反应的进行，C线和T线荧光强度不断产生变化，T/C值也不断变化，但反应17 min后，T/C值基本趋于稳定，说明反应达到动态平衡，故确定试纸条的反应时间为17 min。综合以上条件，能够确定试纸条的检测步骤：1）取4 μL荧光探针加入微孔中，加入50 μL 1.3.5节稀释后的样品提取液，混匀，室温孵育3 min；2）取40 μL上述混合物加到试纸条样品垫上，层析反应17 min后，用荧光免疫分析仪读数；3）将样品的T/C值代入标准曲线方程，计算样品中RB的质量分数。

4

样品预处理条件确定

因RB在水和乙醇中具有高溶解性，分别选择不同体积分数的乙醇溶液作为样品提取剂。如图5所示，随着乙醇体积分数的升高，试纸条抑制率也逐渐升高，乙醇体积分数为40%时抑制率最低，故选择40%乙醇溶液作为样品提取剂。

5

标准曲线的建立

在不含RB的辣椒粉、辣椒油和番茄酱空白样本中添加RB标准品，梯度含量分别为0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/kg，用试纸条进行测试，每个梯度重复3 次，取其平均值，以标准品质量分数的常用对数为横坐标，以T/C值为纵坐标，建立标准曲线。分别以标准曲线方程计算所得的10%抑制浓度（10% inhibition concentration，IC10）作为LOD，以IC20～IC80作为其线性范围，确定本方法对辣椒粉的LOD为1.9 μg/kg，IC50为8.7 μg/kg，线性范围为3.4～22.4 μg/kg（图6a）；对辣椒油的LOD为0.7 μg/kg，IC50为4.6 μg/kg，线性范围为1.4～14.8 μg/kg（图6b）；对番茄酱的LOD为1.5 μg/kg，IC50为5.4 μg/kg，线性范围为2.4～11.8 μg/kg（图6c）。

6

方法的特异性评价

在痕量物质检测中，为评价方法对目标物检测的高度特异性和灵敏性，宜采用低浓度目标物和高浓度类似物进行分析。在方法特异性评价中，分别对质量浓度为5 μg/L的RB和质量浓度为1 000 ng/mL的罗丹明110、罗丹明123、罗丹明6G、结晶紫、对位红、胭脂红等10 种色素用试纸条进行了检测，并用样品稀释液作阴性对照。如图7所示，用试纸条检测高质量浓度的罗丹明110、罗丹明123、罗丹明6G、结晶紫、对位红、胭脂红等色素时，其显色强度及T/C值与阴性对照差异不大，而检测低质量浓度的RB时其显色强度及T/C值下降明显，表明试纸条对于RB有高度特异性，而对其他色素均无明显反应，说明本方法特异性良好。

7

方法的准确度和精密度测定

根据标准曲线方程分别获得对辣椒粉、辣椒油、番茄酱3 种样本的线性范围，在线性范围内选取高、中、低3 个梯度质量分数，对LC-MS/MS确证过的阴性样本做添加回收实验。每个梯度质量分数做6 个重复，计算平均回收率和批内变异，用3 个批次试纸条对同一批样本进行检测，计算批间变异。如表1所示，辣椒粉、辣椒油、番茄酱3 种样本中RB平均添加回收率范围为87.0%～106.1%，批内变异系数为5.4%～11.2%，批间变异系数为6.4%～11.6%。表明本方法具有较好的准确度和精密度。

近年来调味品中RB非法添加报道常见于辣椒及其制品、番茄酱等商品中，本研究选择辣椒粉、辣椒油和番茄酱3 种调味品作为研究对象，考虑到不同调味品可能产生不同的基质效应，故拟合了不同的标准曲线，分别用于辣椒粉、辣椒油和番茄酱中的RB检测，从添加回收实验结果看，方法具有良好的准确度和精密度，表明本方法具有较好的样本适应性，具有推广应用到其他类型调味品的潜力。

8

仪器方法确证

从市场随机采购辣椒粉、辣椒油和番茄酱样品各3 份，用LC-MS/MS检测后均为阴性。在样品中分别添加RB梯度含量为5、10、20 μg/kg，同时用TRFICA法和LC-MS/MS法进行分析，如图8所示，两种方法检测结果具有高度相关性（R2＝0.941 3），说明本方法检测结果可靠，可用于调味品中RB的快速筛查。

9

与其他方法的比较

TRFICA与已有检测方法的比较如表2所示。UPLCMS/MS法等虽然具有较高的灵敏度，但需要大型昂贵仪器和专业技术人员、成本高、检测时间较长，不宜作为快速筛查和现场检测方法。紫外-可见分光光度法需要将样品中RB浓缩后才可实现痕量检测，灵敏度较低。电化学分析法虽然较为灵敏，但易受样品中电活性物质干扰，样品预处理较为复杂，导致分析时间延长。表面增强拉曼光谱分析方法虽然检测快速，但对基底亲和力要求高，对基质干扰敏感，其灵敏度有待进一步提高。ELISA方法虽然灵敏，但需要多次孵育和洗涤，操作过程繁琐、耗时长，难以满足快速检测需求。目前研究报道的免疫层析法主要是胶体金法，该法虽然操作简单、检测成本低，但胶体金纳米粒子亮度低、灵敏度较差。本研究建立的TRFICA方法具有LOD低、检测时间短、样品预处理简单、回收率高的特点，无论在灵敏度上还是检测效率上，都具有一定优势，且检测设备方便携带，能够满足现场快速检测需求，是对现有检测方法的有益补充。

10

结 论

目前对食品中RB的快速检测方法报道较少，本研究基于时间分辨荧光标记技术和侧流免疫层析技术，开发了RB的TRFICA法，可用于调味品中RB的快速定量检测。本研究建立的方法操作简单，待检样本经一步提取后即可通过试纸条实现对RB的检测，结果可在17 min内获得，其在辣椒粉、辣椒油和番茄酱中LOD分别为1.9、0.7、1.5 μg/kg，均低于现行标准检测方法SN/T 2430—2010（LOD：5 μg/kg）。通过特异性实验、添加回收实验可知，本研究所构建方法具有良好的特异性、准确度和精密度。通过仪器确证实验验证了本方法的准确性和可靠性，表明本方法可用于调味品中RB的快速筛查。本研究初步探讨了时间分辨荧光标记技术和侧流免疫层析技术在RB检测应用上的可行性，可为RB荧光定量试纸条的开发奠定基础，但研究还存在着不同调味品类型标准曲线不统一、检测灵敏度需进一步提高、设备智能化水平不高等问题，开展系统的样品预处理方法研究，开发信号更强的标记物，探索机器学习和人工智能在检测体系中的应用研究是解决上述问题的未来发展方向。

作者简介

通信作者：

王照鹏 讲师

枣庄学院食品科学与制药工程学院

2009年7月至2014年8月在北京维德维康生物技术有限公司从事食品中有害物质快速检测产品研发工作，2014-2018年在中国农业大学攻读博士学位，2018年6月博士毕业并到枣庄学院工作，主要研究方向为食品中危害物快速检测技术。 主持山东省重点研发计划项目1 项，参与国家级和省市级科研课题多项，在Food Chemistry，Journal of Food Composition and Analysis，Food Analytical Methods等食品类专业期刊发表学术论文多篇，参与申请并获授权专利１０余项。

引文格式：

王照鹏, 高馨妍, 刘潇晴, 等. 利用时间分辨荧光免疫层析法测定调味品中的罗丹明B[J]. 食品科学, 2026, 47(2): 1-9. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250822-159.

WANG Zhaopeng, GAO Xinyan, LIU Xiaoqing, et al. Determination of rhodamine B in condiments by time-resolved fluorescence immunochromatography[J]. Food Science, 2026, 47(2): 1-9. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250822-159.

实习编辑：杨倩；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、 重庆市农业科学院、 重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、 重庆三峡科技大学 、西华大学、成都大学、四川旅游学院、北京联合大学、 中国-匈牙利食品科学“一带一路”联合实验室（筹） 共同主办 的“ 第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会 ”， 将于2026年4月25-26日 （4月24日全天报到） 在中国 重庆召开。

长按或微信扫码进行注册

为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽农业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、安徽省农科院农产品加工研究所、安徽科技学院、皖西学院、黄山学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“第六届食品科学与人类健康国际研讨会”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到）在中国 安徽 合肥召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）