NSMB | 马丽佳团队破解CRISPR 高保真编辑难题，延长sgRNA 让SuperFi-Cas9实现精准高效编辑

CRISPR 基因组编辑技术源自细菌的适应性免疫系统，通过一种可编程 RNA 序列能够引导 CRISPR 核酸酶在哺乳动物细胞中识别互补序列，实现对特定基因位点的精准编辑，在生物医学领域有巨大的开发潜力。但长期以来，高保真与高效率难以兼得成为制约其临床转化的核心难题——高保真Cas9 变体虽能大幅降低脱靶风险，却普遍存在靶向切割活性显著下降的问题。

2026 年 3 月 18 日，西湖实验室马丽佳、黄晶团队在NatureStructural and Molecular Biology发表了题为Improving the efficiency of High-Fidelity Cas9 by enhancing PAM-distal interactions的研究论文，介绍了团队在 CRISPR 高保真编辑领域取得的突破性进展。研究团队首创sgRNA间隔区（spacer）延长策略，仅通过将向导RNA（sgRNA）的间隔区从常规20个核苷酸延长至21-22个核苷酸，就成功恢复高保真酶SuperFi Cas9的切割活性，同时保留其超高特异性，让高保真Cas9实现“精准且高效”。该成果为基因编辑及 CRISPR 技术的临床安全应用开辟全新路径。同时，团队应杂志邀请，同期发表了 "Extending guide RNA length re-stores high-fidelity CRISPR-Cas9 activity" 的研究简报，介绍该项工作。

行业痛点：高保真 Cas9 “精准有余、效率不足”

在细菌的免疫系统中，为了快速识别并切割病原体，天然 CRISPR 核酸酶对错配序列具有一定程度的灵活性。然而，如果要将该核酸酶用于基因组编辑，则需要精确的靶向和编辑。

近年来，多项研究针对 CRISPR 核酸酶，尤其是 SpCas9 ，开展了工程化改造，成功开发出多种高保真核酸酶变体，能够显著减少脱靶编辑的发生。但这类工程化酶在提高特异性的同时，也降低了酶的靶向编辑效率。最近一项研究在 RuvC 结构域引入 7 个互作残基突变为带负电荷的天冬氨酸，设计了一种新型高保真酶 SuperFi-Cas9 ，旨在不降低靶向编辑效率的前提下提升编辑特异性。然而后续研究表明， SuperFi-Cas9 还是出现了预期之外的活性降低，成为高保真 CRISPR 工具的共性难题。

突破发现：延长 sgRNA ，激活高保真酶活性

团队通过高通量编辑实验评估，首次发现 SuperFi Cas9 在常规使用的 20 - nt sgRNA 之外，对 PAM 远端第 21 位核苷酸存在独特序列偏好，提示 PAM 远端靶点序列相邻区域对 SuperFi ‑ Cas9 的切割活性至关重要。

为验证该假设，团队设计 5' 端延长的 sgRNA （长度 2 1 ‑ 24 核苷酸），实验验证显示：

• 与传统的 20-nt sgRNA spacer 序列相比， 21-nt 或 22-nt 的 spacer 序列可有效恢复 SuperFi-Cas9 的切割活性，同时维持其高保真特性。

• 携带 5' 端延伸 sgRNA 的 SuperFi-Cas9 在内源位点的切割活性可达野生型 spCas9 的 97.1% 。

机制解密：冷冻电镜揭示“电荷补偿”核心原理

团队通过冷冻电镜技术，揭示了5' 端延长的 sgRNA 恢复 SuperFi-Cas9 活性的机制。 SuperFi-Cas9 在 RuvC 结构域中引入的带负电荷的残基突变，由于和 sgRNA- 靶向链（ target strand, TS ）双链互斥，导致 PAM 远端的局部结构稳定性缺失，从而削弱了切割活性。延长的 sgRNA 可通过与 RuvC 结构域中包含 Lys929 、 Lys948 和 Arg951 的环结构相互作用，补偿缺失的局部稳定性。与野生型 SpCas9 相比，该区域在 SuperFi-Cas9 的靶向编辑过程中发挥着更为关键的作用。

工具应用： AI 模型一键优选最佳 sgRNA

除了长度， spacer 序列的组成也显著影响切割效率。为优化基因编辑中的靶点选择和 spacer 长度设计，团队自主开发了深度学习模型 AIdit-SuperFi ，用于预测不同长度 sgRNA 引导的 SuperFi-Cas9 系统的编辑效率与特异性。该模型提供配备用户友好的图形界面，可通过 https://aidit-superfi.wllsb.edu.cn/ 访问和使用，可辅助设计最优间隔区长度，实现 SuperFi ‑ Cas9 的高效高保真 CRISPR 基因编辑。

西湖大学博士研究生郑嵘、西湖云谷智药陆志科、魏荣巍、南方科技大学 Young-Cheul Shin 博士、西湖大学博士研究生杜江为本论文的共同第一作者。西湖实验室、西湖大学马丽佳研究员（现昌平实验室领衔科学家）和黄晶研究员为本文共同通讯作者。本研究受到西湖实验室资助，由西湖云谷智药共同参与完成。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-026-01753-3

制版人： 十一

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