一文get原代地鼠肾实质细胞提取！从组织分离到培养维护全掌握

忙活大半天，地鼠处死了，肾脏取出来了，剪刀剪了半天，消化也做了——结果呢？细胞没贴壁，或者贴壁的全是成纤维细胞，再或者一夜之间培养皿里漂着一层白毛。

原代肾实质细胞提取，翻车的方式远比成功的方式多。

酶解时间差两分钟，细胞活性掉一半；离心转速没算对，想要的细胞全丢了；培养基少加一样因子，目的细胞根本不长。更别提杂细胞污染这个老大难——成纤维细胞贴着贴着就把肾小管上皮细胞挤没了。

这份原代地鼠肾实质细胞分离提取及培养Protocol，正是针对这些高频翻车点来的。从组织离体到细胞贴壁，把消化时间、离心参数、培养基配方、杂细胞控制这些关键环节的参数和操作逻辑全部拆解清楚。照着做，至少能帮你避开80%的坑。

1. 实验目的

高效分离、提取健康地鼠的肾实质细胞（主要为肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞等），建立稳定的原代培养体系，获得高活性、高纯度的肾实质细胞，为后续细胞生物学实验、血清筛选等研究提供合格的细胞材料。

2. 实验原理

利用机械分离结合酶解消化法，打破地鼠肾脏组织的细胞间连接（如胶原纤维、细胞黏附分子等），释放单个肾实质细胞；通过差速离心去除杂质、红细胞及破碎细胞，保留活性完整的肾实质细胞；在适宜的培养条件（特定培养基、温度、气体环境）下，模拟体内生理环境，使肾实质细胞贴壁生长、增殖，维持其原代细胞特性。

关键要点：严格控制酶解时间和温度，避免过度消化损伤细胞活性；选择适配肾实质细胞的培养基，添加必要的生长因子和血清，抑制成纤维细胞等杂细胞过度生长，提高细胞纯度。

3. 实验材料与仪器

3.1 实验动物

健康SPF级地鼠，1-2周龄（幼鼠肾组织活力高、细胞增殖能力强，杂细胞污染少），雌雄不限，体重5-10g；实验前禁食12h，自由饮水，适应性饲养1-2d。

3.2 试剂耗材（无菌级）

（1）基础培养基：DMEM/F12培养基（1:1），不含血清和抗生素；

（2）消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（胰蛋白酶终浓度0.25%，EDTA终浓度0.02%），提前37℃预热；

（3）终止液：含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基，提前37℃预热；

（4）清洗液：PBS缓冲液（pH7.2-7.4），添加青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL），高压蒸汽灭菌后4℃保存；

（5）完全培养基：DMEM/F12培养基（1:1）+ 10% FBS + 1%双抗（青霉素100U/mL+链霉素100ug/mL）+ 0.1%胰岛素转铁蛋白硒（ITS）+ 10ng/mL表皮生长因子（EGF），过滤除菌后4℃保存，现配现用；

（6）其他试剂：75%乙醇（无菌）、0.22μm滤器、台盼蓝染色液（0.4%）；

（7）无菌耗材：培养皿（60mm/100mm）、离心管（15mL/50mL）、移液管（1mL/5mL/10mL）、手术器械包（眼科剪、眼科镊、止血钳）、无菌纱布、一次性无菌手套、口罩、帽子。

3.3 实验仪器

（1）细胞培养箱：37℃、5% CO₂、饱和湿度；

（2）高速冷冻离心机：转速可调（0-5000r/min），可制冷（4℃）；

（3）超净工作台（生物安全柜）：Class II级，无菌操作环境；

（4）倒置显微镜：配备10x、20x、40x物镜，用于观察细胞形态和活性；

（5）恒温水浴锅：可调节温度（37℃），用于预热试剂和酶解消化；

（6）高压蒸汽灭菌锅：用于灭菌试剂和耗材；

（7）电子天平：精度0.1mg，用于称量试剂；

（8）移液器：10ul、100ul、1000ul，配套无菌吸头；

（9）无菌操作台、酒精灯、试管架、离心管架等。

4. 实验准备

4.1 无菌环境准备

实验前30min，开启超净工作台紫外灯消毒30min，关闭紫外灯后通风10min；用75%乙醇擦拭超净工作台台面、实验仪器（移液器、离心管架等）及手术器械；实验人员穿戴无菌手套、口罩、帽子，双手用75%乙醇消毒，避免杂菌污染。

4.2 试剂与耗材准备

（1）将PBS缓冲液、终止液、完全培养基从4℃冰箱取出，置于37℃恒温水浴锅预热30min；胰蛋白酶-EDTA消化液单独预热，避免血清影响消化效果；

（2）检查无菌耗材包装是否完好，无破损、无漏气，按需摆放至超净工作台内；

（3）配制台盼蓝染色液，过滤除菌后备用；完全培养基现配现用，配制后轻轻颠倒混匀，避免气泡产生。

4.3 实验动物准备

将实验地鼠用颈椎脱臼法处死，立即放入75%乙醇中浸泡5min，彻底消毒体表（尤其是腹部区域），避免体表细菌污染肾脏组织；将消毒后的地鼠转移至超净工作台内，腹部朝上放置，用无菌纱布固定四肢。

5. 实验步骤（无菌操作全程）

5.1 肾脏组织分离

（1）用无菌眼科剪沿地鼠腹部中线剪开皮肤和腹膜，逐层分离组织，暴露腹腔内器官；用眼科镊轻轻拨开肠道、肝脏等器官，找到双侧肾脏（呈暗红色、椭圆形，位于脊柱两侧）；

（2）用止血钳夹住肾脏蒂部（连接肾脏与血管、输尿管的部位），用眼科剪剪断蒂部，取出双侧肾脏，立即放入盛有预冷无菌PBS缓冲液的培养皿中；

（3）用无菌眼科镊剔除肾脏表面的脂肪组织、结缔组织及残留的血管、输尿管，用PBS缓冲液反复冲洗3次，每次冲洗后更换新的PBS，直至肾脏表面无杂质、颜色均匀（暗红色）。

5.2 肾实质细胞机械分离与酶解消化

（1）将清洗干净的肾脏放入新的无菌培养皿中，加入1mL预冷PBS缓冲液，用无菌眼科剪将肾脏剪成1mm³左右的细小组织块（尽量剪碎，避免大块组织影响酶解效果），剪碎过程中可补充少量PBS，防止组织干燥；

（2）用无菌移液管将组织块转移至15mL无菌离心管中，加入5mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻颠倒离心管，使组织块与消化液充分混合；

（3）将离心管放入37℃恒温水浴锅中，酶解消化15-20min，期间每5min轻轻颠倒离心管1次，观察组织块变化（组织块逐渐分散、变浑浊，说明消化有效）；

（4）当组织块大部分分散成细小颗粒、离心管内液体呈浑浊状时，立即加入5mL预热的终止液，轻轻颠倒混匀，终止胰蛋白酶的消化作用（避免过度消化导致细胞破裂、活性下降）；

（5）用无菌移液管反复吹打离心管内的混合物20-30次（吹打力度适中，避免产生大量气泡损伤细胞），使组织块进一步分散，释放单个细胞；吹打后静置2min，让未消化完全的组织块沉淀，吸取上清液（含单个细胞）至另一支15mL无菌离心管中；

（6）向剩余未消化完全的组织块中，再加入3mL预热的胰蛋白酶-EDTA消化液，再次消化、终止、吹打、收集上清液，合并两次收集的上清液（最大限度获取单个细胞）。

5.3 细胞纯化与离心洗涤

（1）将合并后的细胞悬液放入高速冷冻离心机中，4℃、1000r/min离心5min，弃上清液（含胰蛋白酶、终止液及破碎细胞），沉淀为肾实质细胞；

（2）向离心管中加入5mL预冷的无菌PBS缓冲液，用无菌移液管轻轻吹打沉淀，使细胞重新悬浮，制成细胞悬液；4℃、1000r/min离心5min，弃上清液，重复洗涤2次（去除残留的酶液、血清及杂质，提高细胞纯度）；

（3）末次离心后，弃上清液，向离心管中加入2mL完全培养基，轻轻吹打沉淀，使细胞均匀悬浮，制成单细胞悬液。

5.4 细胞活力检测与接种

（1）细胞活力检测：取10ul细胞悬液与10ul台盼蓝染色液混合均匀，静置3min后，滴加至血细胞计数板上，置于倒置显微镜下观察计数；活细胞呈无色透明，死细胞被台盼蓝染成蓝色，计算细胞活力（活细胞数/总细胞数×100%），活力≥90%方可用于接种；同时计数细胞浓度，调整细胞浓度至1×10⁶-5×10⁶个/mL；

（2）细胞接种：将无菌培养皿（60mm）置于超净工作台内，每皿加入6mL调整好浓度的细胞悬液，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布在培养皿底部（避免细胞聚集）；

（3）接种完成后，在培养皿盖边缘做好标记（注明细胞名称、接种日期、实验人员），将培养皿放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中，静置培养。

5.5 原代细胞培养与换液

（1）接种后24h内，避免移动培养皿，让细胞充分贴壁（肾实质细胞贴壁较慢，24h后可在倒置显微镜下观察到少量贴壁细胞，呈梭形或多边形）；

（2）首次换液：接种后48h，取出培养皿，在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，轻轻吸弃上清液（避免吸到贴壁细胞），加入2mL新鲜的完全培养基，轻轻晃动培养皿，冲洗贴壁细胞表面的残留杂质，再吸弃培养基，重新加入6mL新鲜完全培养基，放入培养箱继续培养；

（3）常规换液：之后每2-3天换液1次，换液操作同首次换液，换液时观察细胞形态、密度及有无污染（若培养基变浑浊、出现白色絮状物，说明存在细菌污染；若出现圆形、漂浮的异常细胞，说明可能存在真菌污染，需及时处理）；

（4）细胞传代：当细胞密度达到80%-90%汇合时（倒置显微镜下观察，细胞铺满培养皿底部，相互接触但未重叠），进行传代培养（原代细胞传代次数不宜过多，一般传3-5代，避免细胞老化、特性改变）。

5.6 细胞传代步骤

（1）吸弃培养皿中的旧培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗贴壁细胞2次，吸弃PBS；

（2）加入1mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动培养皿，使消化液均匀覆盖细胞表面，放入37℃培养箱中消化3-5min，期间在倒置显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大、开始脱落时，立即加入1mL终止液，终止消化；

（3）用无菌移液管轻轻吹打培养皿底部，使贴壁细胞完全脱落，制成细胞悬液，转移至15mL离心管中；

（4）4℃、1000r/min离心5min，弃上清液，加入2mL完全培养基，吹打均匀，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL左右；

（5）将细胞悬液接种至新的无菌培养皿中，每皿加入6mL，标记后放入培养箱继续培养，传代比例建议1:2-1:3。

6. 注意事项

（1）无菌操作是实验成功的关键，全程在超净工作台内进行，实验器械、耗材、试剂需严格灭菌，实验人员需做好无菌防护，避免杂菌污染；

（2）酶解消化是核心步骤，需严格控制消化时间和温度，避免过度消化（导致细胞活性下降、破裂）或消化不充分（细胞分散不佳、产量低）；消化过程中需密切观察组织块变化，及时终止消化；

（3）细胞吹打时力度要适中，避免用力过猛产生大量气泡，气泡会损伤细胞；吹打要充分，确保细胞分散成单个细胞悬液，避免细胞聚集影响贴壁和生长；

（4）所有试剂需提前预热至37℃（除PBS可预冷外），避免温度骤变损伤细胞；离心时温度控制在4℃，转速和时间准确，避免离心过快导致细胞破裂；

（5）培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞形态、贴壁情况、密度及有无污染，发现异常及时处理（如污染细胞需立即丢弃，避免交叉污染）；

（6）胎牛血清、EGF、ITS等添加试剂需妥善保存（-20℃或-80℃），避免反复冻融，影响其活性；完全培养基现配现用，配制后4℃保存不超过1周；

（7）实验动物处死需符合伦理要求，操作轻柔，避免过度损伤肾脏组织；肾脏组织取出后需尽快处理，避免放置时间过长导致细胞活力下降；

（8）台盼蓝染色后需在5min内完成细胞计数，避免染色时间过长导致活细胞被染色，影响计数结果。

7. 质量控制标准

（1）细胞活力：原代分离后细胞活力≥90%，传代后细胞活力≥85%；

（2）细胞纯度：倒置显微镜下观察，肾实质细胞（梭形、多边形，贴壁生长）占比≥90%，杂细胞（如成纤维细胞、红细胞）占比≤10%；可通过免疫细胞化学染色（如肾小管上皮细胞标志物CK18、肾小球系膜细胞标志物α-SMA）进一步验证纯度；

（3）细胞形态：贴壁后的肾实质细胞形态规则，呈梭形或多边形，胞质均匀，细胞核清晰，无异常形态（如细胞肿胀、破裂、空泡化）；

（4）培养稳定性：原代细胞可稳定贴壁生长，换液后细胞形态无明显异常，传代后3-5天可达到80%-90%汇合，传3-5代后仍维持原代细胞特性；

（5）无菌要求：培养过程中无细菌、真菌、支原体等污染，培养基清澈透明，无浑浊、无白色絮状物，细胞无异常漂浮。

8. 实验废弃物处理

（1）实验动物尸体：放入专用生物废弃物收集袋中，进行高压蒸汽灭菌后，按生物安全废弃物处理规定统一丢弃；

（2）细胞悬液、培养基、消化液等液体废弃物：加入含消毒剂（如84消毒液）的收集容器中，浸泡30min后，倒入专用废液处理管道；

（3）无菌耗材（离心管、移液管、培养皿等）：使用后放入专用生物废弃物收集袋中，高压蒸汽灭菌后，按医疗废弃物处理；

（4）实验器械：使用后用75%乙醇擦拭消毒，再进行高压蒸汽灭菌，晾干后妥善保存，备用。

9. 实验备注

（1）本Protocol适用于1-2周龄SPF级地鼠，若使用成年地鼠，需适当延长酶解时间（20-25min），且细胞活力和增殖能力可能下降；

（2）胰蛋白酶-EDTA消化液的消化效果受浓度、温度影响较大，若消化效果不佳，可适当提高胰蛋白酶浓度（不超过0.3%）或延长消化时间（不超过25min）；

（3）若需获得单一类型的肾实质细胞（如仅肾小管上皮细胞），可在细胞贴壁后48h，利用差速贴壁法（成纤维细胞贴壁速度快于肾小管上皮细胞）去除成纤维细胞，或使用免疫磁珠分选法进一步纯化；

（4）细胞培养过程中，可根据细胞生长情况调整换液时间（如细胞密度增长较慢，可延长至3-4天换液1次；若细胞密度增长较快，可缩短至2天换液1次）；

（5）实验过程中需做好实验记录，包括动物信息、接种细胞数、细胞活力、换液时间、传代次数、细胞生长情况等，便于后续实验追溯和重复。

原代细胞的提取与培养，既是一门技术，也是一门艺术。从无菌操作的严谨，到酶解时间的把控，再到细胞生长的观察，每一步都考验着实验者的耐心与细致。希望这份Protocol能为你提供清晰的操作指引，帮助你在科研道路上少走弯路，收获更多高质量的实验数据。

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