帮你搞定所有实验设计 — 肿瘤微环境篇

如果你的课题涉及到肿瘤微环境、 CAR-T 或器官芯片，这篇 Nature 子刊能教你搞定所有实验设计。

最近有不少做免疫治疗、器官芯片、肿瘤微环境的朋友私信小编，问顶刊的实验设计到底有什么门道。今天就带大家深度解析一篇 2025 年 7 月发表在《Nature Biomedical Engineering》上的重磅研究 ——「Bioengineered immunocompetent preclinical trial-on-chip tool enables screening of CAR T cell therapy for leukaemia」（通讯作者：纽约大学陈伟强团队、宾夕法尼亚大学 Saba Ghassemi 团队）。

这篇文章的设计思路可大致总结为：构建仿生芯片模型 → 验证模型生理相关性 → 动态监测 CAR-T 杀伤过程 → 解析微环境互作机制 → 模拟临床反应场景 → 筛选优化 CAR-T 产品 → 个性化患者响应预测。文章以实验为主，单细胞测序部分只做了验证性分析，但整体的工作量确实不小！对 CAR-T 疗法、器官芯片、肿瘤免疫微环境方向感兴趣的朋友，这篇文章的实验方法都可以参考，想设计其他思路的朋友也可以直接借鉴这套逻辑。分子互作和单细胞分析技术现在用得越来越多了，想在文章中加上这些技术的朋友也可以继续往下看哦 ～

设计思路

1、通过构建三维微流控芯片模型，模拟人白血病骨髓的解剖结构和病理生理特征：

研究团队首先设计了一个三区域微流控芯片：中央窦区（血管化）、髓腔区（填充造血细胞、基质细胞和白血病细胞）、骨内膜区（成骨细胞和成纤维细胞）。芯片采用 PDMS 复制模塑法制备，将人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞、成骨细胞、骨髓单个核细胞和 Reh B-ALL 细胞按生理密度接种于纤维蛋白水凝胶中，培养 5-7 天诱导血管网络自组装。

2、通过单细胞测序验证芯片模型的生理相关性：

为了验证工程化骨髓微环境与体内真实情况的相似性，研究团队利用单细胞 mRNA 测序技术，对比分析了芯片中收集的细胞样本与新鲜骨髓单个核细胞的细胞组成。测序结果验证了骨髓芯片在培养 9 天后仍维持了丰富的造血细胞和基质细胞组成，与体内骨髓相当。通过免疫荧光染色进一步证实了髓系（CD14+单核细胞、CD68+巨噬细胞）和淋巴系（CD8+和 CD4+ T 细胞）细胞在芯片上的维持。

3、通过实时活细胞成像动态监测 CAR-T 细胞功能：

将 DiD 标记的第二代抗 CD19 4-1BBζ-CAR T cells 细胞注入芯片中央窦，通过实时荧光成像连续监测 7 天。结果发现 CAR-T 细胞在 3 天内清除约 70% 的白血病细胞，7 天达到完全根除（>99%），而 Mock T 细胞或未处理组无法控制白血病进展。研究还捕捉到了 CAR-T 细胞外渗、迁移、识别杀伤的全过程，量化了 CAR-T 细胞的迁移速度（1.213 μm/min）和运动轨迹。

4、通过流式、ELISA 和单细胞测序解析 CAR-T 细胞功能状态：

通过流式细胞术检测 T 细胞活化标志物 CD25 和 CD69，ELISA 检测细胞因子 IFNγ、颗粒酶 B、穿孔素的分泌，单细胞测序分析基因表达变化。结果证实 CAR-T 细胞与 CD19+靶标相互作用后显著增强活化标志物表达和细胞毒性相关细胞因子分泌，同时上调 T 细胞受体信号通路、Th1/Th2 细胞分化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等信号通路。

5、通过免疫荧光和细胞因子谱分析解析 CAR-T 细胞与骨髓微环境的相互作用：

研究发现 CAR-T 细胞处理诱导血管细胞表面 ICAM-1 表达增强（支持 T 细胞外渗），CD14+单核细胞表面 HLA-DR 表达增强（抗原提呈相关）。细胞因子谱分析显示 CAR-T 细胞诱导了过度的细胞因子产生，如免疫刺激细胞因子 MIP-1β、趋化因子 RANTES、炎症因子 MCP-2 等。单细胞测序分析证实 CAR-T 细胞触发了免疫细胞和基质细胞的系统性反应，如干扰素诱导跨膜蛋白家族表达增强。

6、通过调节效应细胞与肿瘤细胞比例、掺入抗原阴性克隆模拟临床缓解、耐药和复发场景：

为了复制临床复发场景，研究团队在制备白血病芯片时向总白血病群体中掺入 5% 或 1% 的 CD19-白血病细胞；为了模拟耐药场景，将每芯片 CAR-T 细胞数量降至 2,500 个（缓解场景为 10,000 个）。通过荧光成像连续监测 14 天以上，发现 2,500 个 CAR-T 细胞大多无法控制白血病进展（耐药），10,000 个 CAR-T 细胞清除大部分 CD19+细胞但 CD19-细胞不受限制地扩增（复发），与临床观察到的动态模式高度吻合。

7、通过对比不同 CAR 设计、不同培养时间、不同患者来源的 CAR-T 产品验证芯片的筛选能力：

研究比较了第二代 CAR（CD28ζ、ICOSζ、4-1BBζ）和第四代 CAR（4-1BBζ-IL18）的功能表现，发现 4-1BBζ-CAR 分泌更多 IL-13（Th2 细胞因子），CD28ζ-CAR 和 ICOSζ-CAR 分泌更多 IL-10。对比培养 3 天和 9 天的 CAR-T 产品（D3-CAR 和 D9-CAR），发现 D3-CAR 在低剂量时疗效更优，这与其增强的增殖能力（Ki67 高表达）和细胞因子分泌相关。测试 4 位患者来源的 CAR-T 产品，发现只有非 B-ALL 肺癌患者的 CAR-T 细胞（PD145）实现了芯片上的缓解。

8、通过构建患者特异性芯片验证个性化 CAR-T 细胞响应：

使用 3 位匹配的患者样本（PD7606、PD7813、PD8012 骨髓单个核细胞构建患者特异性芯片，匹配的 PD7607、PD7814、PD8009 外周血单个核细胞制备的 4-1BBζ-CAR T 细胞处理芯片），发现患者 CAR-T 细胞在匹配的白血病芯片中显著清除白血病细胞，表面 CD69 表达增强，IFNγ 和其他细胞毒性细胞因子显著高于 Mock T 细胞处理组。

主要结果

1、成功构建了具有生理相关性的免疫活性人白血病骨髓芯片：

通过三区域微流控芯片设计，结合多种原代细胞共培养，成功在体外重建了人白血病骨髓的微结构和病理生理特征。单细胞测序和免疫荧光验证了芯片中造血细胞和基质细胞的多样性维持，血管网络自组装形成，ECM（层粘连蛋白、纤连蛋白、IV 型胶原）沉积重塑，与体内骨髓高度相似。

图 1: 直观展示了这一工程化骨髓芯片的设计思路和构建结果

2、CAR-T 细胞在芯片上实现了对白血病的有效清除并表现出特征性功能状态：

CAR-T 细胞在 7 天内完全清除白血病细胞（>99% 杀伤），实时成像捕捉到 CAR-T 细胞外渗、迁移、识别杀伤的全过程。CAR-T 细胞在与靶标相互作用后显著增强活化标志物（CD25、CD69）表达，细胞毒性相关细胞因子（IFNγ、颗粒酶 B、穿孔素）分泌，上调 T 细胞受体信号通路和免疫反应相关通路。

3、CAR-T 细胞触发了骨髓微环境的系统性免疫反应：

CAR-T 细胞处理诱导血管细胞 ICAM-1 表达增强（促进 T 细胞外渗），单核细胞 HLA-DR 表达增强（促进抗原提呈），并诱导过度的细胞因子产生（MIP-1β、RANTES、MCP-2 等）。单细胞测序证实 CAR-T 细胞触发了免疫细胞和基质细胞的系统性转录变化，如干扰素诱导跨膜蛋白家族表达增强。

4、芯片成功模拟了临床缓解、耐药和复发三种主要反应场景：

通过调节 CAR-T 细胞剂量（缓解：10,000/芯片；耐药：2,500/芯片）和掺入 CD19-细胞（复发：5% 或 1% CD19-细胞），芯片重现了临床观察到的三种主要反应模式。耐药场景中 CAR-T 细胞分布范围受限，复发场景中 CD19-细胞不受限制地扩增，与 209 例患者的临床数据动态模式高度吻合。

5、芯片能够区分不同 CAR 设计和不同培养时间的 CAR-T 产品功能差异：

第二代 CAR 中，4-1BBζ-CAR 分泌更多 IL-13（Th2 细胞因子），CD28ζ-CAR 和 ICOSζ-CAR 分泌更多 IL-10。D3-CAR（培养 3 天）在低剂量时疗效优于 D9-CAR（培养 9 天），这与 D3-CAR 增强的增殖能力（Ki67 高表达）和细胞因子分泌相关。第四代 CAR（4-1BBζ-IL18）在功能表现上优于第二代 CAR。

6、芯片能够评估患者来源 CAR-T 细胞的功能差异并预测个性化响应：

4 位患者来源的 CAR-T 细胞中，只有非 B-ALL 肺癌患者的 PD145 CAR-T 细胞实现了芯片上的缓解，其他 B-ALL 患者的 CAR-T 细胞功能明显减弱。3 位匹配的患者样本验证了患者 CAR-T 细胞在自体白血病芯片中的特异性激活和杀伤效应，不同患者的 CAR-T 细胞功能差异显著。

7、芯片为 CAR-T 细胞产品的临床前评估提供了多维度的功能指数：

基于 T 细胞活化、增殖、迁移、细胞因子分泌等多个参数，研究建立了 CAR-T 细胞功能指数评估体系，能够系统比较不同 CAR-T 产品的功能表现，为优化 CAR-T 细胞制造和筛选提供了可靠的工具。

小编建议：

从图片数量就能看出这篇文章的工作量，从模型构建到生理验证，从动态监测到机制解析，从临床场景模拟到产品筛选优化，从健康供体到患者来源样本，层层递进，想进军 Nature 子刊的就照这个标准来设计。

这篇文章最值得借鉴的是它的实验设计逻辑：先是用单细胞测序和真实人体数据比对，严谨验证生理相关性。然后讲清楚了 CAR-T 细胞怎么进去、怎么找、怎么杀。从「观察」到「机制」再到「应用」，观察到现象（CAR-T 杀伤）→ 解析机制（微环境 ICAM-1、HLA-DR、细胞因子变化）→ 功能应用（模拟临床场景、筛选优化产品），形成逻辑闭环。最后用临床场景检验模型价值，并用患者样本验证。

没时间设计思路或者不会单细胞数据分析的朋友可以多琢磨这套逻辑。

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01428-2

参考文献：Ma C, Wang H, Liu L, Chen R, Mukherjee N, Tong J, Kazmi S, Fang X, Witkowski MT, Aifantis I, Ghassemi S, Chen W. Bioengineered immunocompetent preclinical trial-on-chip tool enables screening of CAR T cell therapy for leukaemia. Nat Biomed Eng. 2025 Dec;9(12):2098-2114.

题图：自制

编辑：冷漠小 z