CHO 细胞培养补料优化：硫胺素的稳定性与必要性大揭秘

摘要:本次针对生物制药用细胞培养补料中的硫胺素展开研究，通过LC-MS/MS技术探究其在液体补料中的降解规律，发现该物质易氧化且与多种补料成分发生相互作用。经批次补料实验验证，4种CHO细胞株在无硫胺素补料培养下，细胞性能、重组蛋白关键质量属性均未受影响，胞内胞外代谢组也无显著变化。这一发现为开发室温稳定的浓缩补料提供了简单可行的思路——移除这一不稳定且非必需的维生素。

一、研究背景：细胞培养补料开发的核心痛点

做生物制药细胞培养的同行都清楚，化学限定性补料是重组蛋白生产的关键。这类补料成分复杂，高浓度下的稳定性一直是工业生产的难题。光照、温度变化，都可能让补料中的营养成分降解、相互作用，进而影响细胞生长和蛋白质量。

硫胺素作为细胞能量代谢的必需维生素，本身易受温度和氧化影响。在高浓度液体补料中，它的稳定性到底如何，是否真的需要在补料中额外添加，都是亟待验证的问题。毕竟开发室温稳定、成分精简的补料，是工业生物制造的核心需求。

二、实验设计：从稳定性到必要性的全面验证

本次研究分两大核心部分，先搞清楚硫胺素的降解问题，再验证它在补料中的必要性。稳定性研究中，我们配置了3种定制化干粉补料，复溶后在23℃、37℃甚至70℃下避光储存，最长达98天，用LC-MS/MS追踪硫胺素及产物变化（图1）。

图1 维生素浓度在不同储存条件、不同补料配方中的变化，红色标注硫胺素易氧化还原的化学基团，灰色区域为方法学技术变异范围

必要性验证则用4种CHO细胞株做批次补料实验，分别用含硫胺素和无硫胺素的补料培养，监测细胞生长、活力、蛋白产量，同时分析蛋白糖基化、聚集、电荷变体等关键质量属性，还用非靶向LC-MS/MS分析胞内胞外代谢组。

为了精准识别硫胺素的降解和相互作用产物，我们还设计了缺特定成分的补料实验组，通过靶向搜索，区分纯降解产物和与其他成分的相互作用产物，最终整理出硫胺素衍生特征物数据库（表1）。

表1 储存过程中检测到的主要硫胺素降解/相互作用产物

产物类型

代表特征物m/z

相互作用/降解原因

含硫物质相互作用产物

5.17_363.0789m/z

与S-磺基半胱氨酸形成二硫键

酮酸相互作用产物

4.65_249.0984m/z

与α-酮戊二酸发生反应

氨基酸相互作用产物

6.56_287.1504m/z

与苯丙氨酸结合

氧化产物

6.23_263.0961m/z

硫胺素自身氧化生成硫色素

三、硫胺素稳定性：易降解，还爱和多种成分“抱团”

储存实验的结果很直观，硫胺素是补料中最不稳定的维生素。23℃储存3个月，其浓度显著下降，37℃下降解速度更快，甚至70℃模拟快速降解时，短时间内就会产生大量衍生产物（图1A、B）。

硫胺素的降解核心是氧化，分子中多个化学基团对氧化还原高度敏感（图1C）。更关键的是，它不只是自己降解，还会和补料中的其他成分发生相互作用。在含不同半胱氨酸源的补料中，硫胺素稳定性进一步降低（图1D、E），和含硫物质、α-酮戊二酸、苯丙氨酸等氨基酸都能形成相互作用产物。

我们共检测到74种可能的硫胺素衍生产物，其中23种为一级鉴定、37种为三级鉴定（图2）。这些产物里，氧化产物、与含硫物质的二硫键产物占比最高，37℃储存时，这类产物的生成量会大幅增加，而添加α-酮戊二酸虽能抑制部分氧化，却会催生新的相互作用产物。

图2 硫胺素不稳定性研究策略及降解/相互作用产物分类，红色标注与硫胺素母核的结构差异

有意思的是，我们测试了这些降解产物对CHO细胞的毒性，即便浓度达到1mM，也未发现细胞活力受影响，这一点倒是让研究少了一层顾虑。

四、硫胺素必要性：补料中移除，完全不影响培养效果

这部分的实验结果，是本次研究最核心的发现。4种不同的CHO细胞株，包括生产不同单抗和融合蛋白的细胞，在无硫胺素补料的培养体系中，生长状态和含硫胺素的对照组几乎一致。

细胞的活细胞密度峰值、存活期都无显著差异，比如1号克隆活细胞密度峰值达16×10⁶cells/mL，2号克隆达17×10⁶cells/mL，无硫胺素补料组均能达到这一水平（图4）。蛋白最终滴度也没受影响，两款单抗分别达到4g/L和7g/L，和对照组持平。

图4 有无硫胺素补料时，CHO细胞的活细胞密度、存活率、蛋白滴度及重组蛋白聚集、电荷变体、糖基化特征

重组蛋白的关键质量属性，是生物制药的核心考核指标。我们检测了蛋白的聚集情况、电荷变体分布和糖基化谱，发现无硫胺素补料组的蛋白，完整峰占比、酸碱变体比例、核心糖基化修饰类型，都和对照组高度一致，没有出现任何异常。

代谢组分析的结果更能说明问题。补料中移除硫胺素后，胞外硫胺素虽几乎耗尽，但胞内的硫胺素二磷酸（TDP，硫胺素的活性形式）始终能检测到，直到细胞活力开始下降（图5）。胞内还有硫胺素单磷酸和游离硫胺素，可随时转化为TDP，满足细胞能量代谢需求。

图5 批次补料培养中，胞内胞外硫胺素及其磷酸化产物的丰度变化，浅色为无硫胺素补料组，深色为对照组

胞内胞外的代谢组整体也无显著差异，仅有少量硫胺素衍生产物的丰度发生变化，其余代谢通路均未受影响（图6）。这说明基础培养基中的硫胺素，已经足够支撑整个批次补料培养过程，补料中额外添加完全没有必要。

图6 有无硫胺素补料时，胞内胞外差异代谢特征物的丰度变化及分类

五、研究启示：精简补料，从移除非必需不稳定成分开始

做这个研究的初衷，是想解决高浓度补料的稳定性问题，没想到最终得出了一个更简单的结论：直接把硫胺素从补料中移除。其实细想，这也符合细胞培养的基本逻辑，维生素作为辅酶，细胞的需求量本就极低，基础培养基的含量已能满足。

工业生物制造中，补料的室温稳定性、成分精简性，直接关系到生产成本和工艺稳定性。硫胺素这类易降解、易发生相互作用的成分，若并非必需，移除就是最优解。这比添加稳定剂、低温储存、分批次配制补料，要简单得多，也更适合规模化生产。

当然，这个结论并非适用于所有细胞培养体系，不同的细胞株、不同的基础培养基配方，可能会有差异。但本次研究提供的思路，值得行业参考：对补料中的每一种成分，都去验证其稳定性和实际必要性，而非一味按照传统配方添加。

某种程度上，这也是下一代细胞培养补料的开发方向——基于实际培养需求，打造成分精简、性能稳定、适配工业生产的配方。而硫胺素的移除，就是这一思路的一次成功实践。

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