Nat Biomed Eng | 戴伦治/赵毅合作利用瓜氨酸化修饰组学新技术结合AI解析类风湿关节炎自身抗原

瓜氨酸化（citrullination）是一种由瓜氨酸脱氨酶（PAD）催化的不可逆、低丰度蛋白质翻译后修饰，质量偏移仅为+0.984Da。由于带正电荷的精氨酸被中性瓜氨酸取代，这种变化可使蛋白质构象、电荷分布及功能状态发生改变。类风湿关节炎（RA）是一种系统性自身免疫性疾病，以滑膜关节慢性炎症和进行性骨破坏为主要病理特征，易导致关节畸形。大量研究表明，在RA发生发展过程中，瓜氨酸化蛋白/肽是驱动自身免疫应答的核心抗原之一，能够诱发关节组织的免疫攻击和持续性炎症。因此，精准识别RA瓜氨酸化自身抗原对其精准诊断与机制研究具有重要意义。然而，蛋白质瓜氨酸化在体内丰度极低，其质量变化易与脱酰胺反应或¹³C同位素峰干扰信号混淆，并且结构变化极其细微导致缺乏特异性泛抗体富集瓜氨酸化肽段。传统瓜氨酸化修饰组学通常是通过化学探针富集策略实现，该方法通常几百微克蛋白以上，而且化学探针反应过程可能导致脱氨反应，造成假阳性。随着生命科学和医学研究向微量化、精细化方向发展，蛋白质修饰研究也亟需适合超微量体系的新技术。

2026年3月3日，四川大学华西医院戴伦治和赵毅团队合作在Nature Biomedical Engineering上发表题为“Low-inputdeep learning platform for citrullinated peptide identification, autoantigen discovery, and rheumatoid arthritis treatment stratification”的研究论文。该研究建立了基于内标辅助的纳克级蛋白质瓜氨酸化修饰组学新技术。研究人员利用该技术解析了从正常人、RA风险个体到RA确诊病人整个疾病演进过程中瓜氨酸化的动态变化规律，并建立了疾病活动度与瓜氨酸化的关系。结合瓜氨酸化肽段和临床指标，该研究构建了针对甲氨蝶呤加来氟嘧啶（MTX+LEF）、甲氨蝶呤加羟氯喹（MTX+HCQ）两种常用用药方案的治疗响应预测模型，为RA精准用药提供了决策依据。此外，研究人员基于大规模ELISA数据训练了融合自注意力机制的BiGRU模型预测瓜氨酸化肽段的RA血清反应活性，推动了RA自身抗原发现。

针对超微量样品中瓜氨酸化修饰深度解析的挑战，研究人员创新性地开发了一种无需亲和富集、基于TMT标记内标辅助的纳克级蛋白瓜氨酸化组学新技术（Iseq-Cit技术），被检测的血浆样品无需预先去除高丰度蛋白，且每个样品的实际多肽上样量仅为375纳克。相较于该团队于2025年5月26日发表的基于TMT标记的化学乙酰化内标的高通量乙酰化修饰检测新技术Iseq-Kac（详见BioArt报道：），Iseq-Cit技术采用PAD酶体外催化制备瓜氨酸化内标，弥补了部分修饰内标难以化学合成的局限，并且酶催化瓜氨酸化内标能更真实地模拟细胞内修饰状态。Iseq-Cit技术通过使用瓜氨酸化内标，显著增强了样品中瓜氨酸化修饰多肽一级质谱信号，并有效触发二级质谱碎裂，从而有效地提升了修饰肽段的检测灵敏度，大幅降低了蛋白用量。研究人员进一步分离了人源抗环瓜氨酸化肽抗体（ACPAs）富集血浆样品中的瓜氨酸化肽段，并通过靶向质谱分析对Iseq-Cit技术检测到的部分瓜氨酸化肽段进行验证，高达81.6%的瓜氨酸化肽段得到了靶向确认，而靶向分析中没有鉴定到的瓜氨酸化肽段也并不意味着其不存在，可能与纯化的人源ACPAs识别底物覆盖度不足有关。

为了揭示RA演进过程中瓜氨酸化修饰的动态规律，研究人员利用高灵敏度的Iseq-Cit技术对711份人血浆样本进行了高通量瓜氨酸化组学分析，涵盖了357例RA患者、56名RA高风险个体及99名健康对照。其中，272例RA患者在首诊后完成了一次随访和血样提供，59例RA患者完成了2次随访和血样提供。另外，RA高风险人群中有34例患者完成了5-7年随访。研究发现，在RA高风险个体中即存在瓜氨酸化异常，瓜氨酸化修饰主要富集于炎症应答、补体激活和凋亡细胞清除等免疫相关通路，提示此阶段已发生免疫激活。而在确诊RA患者中，瓜氨酸化修饰显著富集于核相关过程，如核小体组装和染色质重塑，提示炎症状态下转录和翻译活动增强。此外，研究人员还对8例人滑膜样本进行了瓜氨酸化组学分析，发现RA患者滑膜组织中瓜氨酸化水平较OA患者高，且这些瓜氨酸化修饰主要富集于细胞外基质（ECM）蛋白、SLIT/ROBO信号通路和成骨抑制过程，提示RA滑膜中存在活跃的ECM降解和炎症性结构重塑。

RA个体化治疗方案的确立有助于减少无效治疗和不良反应，降低致残率。研究发现，在接受MTX+LEF或MTX+HCQ治疗的RA患者中部分瓜氨酸化肽水平在治疗反应良好组中显著低于无效组，且其变化独立于对应蛋白的表达，提示瓜氨酸化肽段可能作为疗效预测指标。该研究进一步构建结合瓜氨酸化肽和临床指标的治疗反应预测模型，发现KNN分类器在独立队列中表现良好：MTX+LEF组的AUROC为88.3%，MTX+HCQ组为79.4%，显著优于使用临床指标、随机肽段或者临床指标加随机肽段构建的预测模型，为RA精准用药提供了新的决策依据。

鉴于ACPAs在RA关节损伤进展中的关键作用，识别新的瓜氨酸化表位对于完善RA早期诊断方法、理解发病机制及阐明ACPAs的产生与交叉反应机制至关重要。然而传统依赖ELISA的RA血清反应的抗原肽筛选方式成本高、效率低。为此，该研究构建了一个深度学习模型预测瓜氨酸化肽的RA患者血清反应活性。研究人员收集了8,816条阳性肽和67,399条阴性肽，基于20种天然氨基酸和瓜氨酸的10项理化性质进行编码，采用10折交叉验证建立10个子模型，并对阳性样本进行数据增强以平衡训练集。在BiGRU、CNN、CRNN和Transformer等模型中，BiGRU表现最佳。利用BiGRU模型，研究人员预测了来源于病人血浆和滑膜组织中2,562条瓜氨酸化肽的RA血清反应活性，并随机挑选了其中25条预测阳性肽和13条预测阴性肽在独立队列中进行ELISA验证，ELISA结果显示预测准确率高达84.2%。研究还发现这些瓜氨酸化肽段在RA患者血清中反应活性显著高于其他疾病人群，显示出良好的疾病特异性。

综上所述，该研究开发了一种高灵敏度免富集微量蛋白质瓜氨酸化解析新技术系统绘制了RA进展各阶段的瓜氨酸化图谱，明确瓜氨酸化修饰与RA疾病活动度和治疗响应的关系，证实了部分瓜氨酸化肽段具有早期诊断和预测药物治疗反应潜力，建立了深度学习模型准确预测瓜氨酸化肽段的RA血清反应活性。该研究为RA的诊断、精准用药和发病机制研究提供了新思路，也拓展了AI技术在蛋白质修饰研究中的应用。

四川大学生物治疗全国重点实验室和华西医院国家老年疾病临床研究中心戴伦治研究员、四川大学华西医院风湿免疫科赵毅教授为本文的共同通讯作者，四川大学生物治疗全国重点实验室胡梦博士、四川大学风湿免疫科华西医院朱晨曦博士、孙蕊博士、龚艳秋博士和刘艺副教授、以及天府锦城实验室许志强博士为本文的共同第一作者。感谢华西医院实验医学科应斌武主任、瑞典卡罗琳斯卡医学院Rikard Holmdahl教授等老师给予的课题指导。

https://www.nature.com/articles/s41551-026-01628-4

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