Genes Dev丨ERH和SAFB1/2 在miRNA cluster assistance中的作用机制

microRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为22 nt的小非编码RNA，广泛分布于动植物细胞中并参与绝大部分细胞内源基因的表达调控。miRNA基因从基因组转录后生成具有hairpin结构的primary miRNA (pri-miRNA)，在细胞核内被Microprocessor (Drosha/DGCR8复合物) 识别并切割生成短的precursor miRNA (pre-miRNA)，后者被转运出核，并在细胞质中被Dicer蛋白进一步识别并切割，然后被包含Argonaute (Ago) 蛋白在内的RISC复合物结合、成熟，并发挥对下游靶基因的调控功能【1】。miRNA生成的第一步（即pri-miRNA的识别与加工）直接决定了基因组转录出来的海量RNA hairpin中哪些可以被Microprocessor识别并最终产生成熟的miRNA。之前的研究表明只有具备一定的结构以及序列特征（optimal features）的RNA hairpin才能成为miRNA前体，并被Microprocessor高效加工。但有研究发现一些不具备optimal pri-miRNA特征的RNA hairpin（suboptimal miRNA）也能够被Microprocessor识别并加工产生成熟的miRNA，其背后机制一直不清楚。人类基因组中超过40%的miRNA与其它miRNA位于同一转录本内，这些串联的miRNA被称为miRNA 簇（miRNA cluster）。自miRNA发现以来，领域内一直认为miRNA cluster内的每个miRNA成员的加工生成都是按照上述途径独立进行的。2020年，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）的Eric Lai实验室以及另外两个实验室（David Bartel lab 和 Sebastian Herzog lab）同时报道了一种全新的miRNA cluster加工调控机制：不具备optimal miRNA前体特征的suboptimal pri-miRNA本身不能直接被Microprocessor高效识别和加工，但当它们与其它optimal miRNA基因位于同一miRNA cluster时，这些附近的optimal pri-miRNA邻居可以高效招募Microprocessor并进一步促进旁边suboptimal pri-miRNA的加工成熟，这一作用方式被称为miRNA cluster assistance【2-4】。继这一发现之后，Eric Lai实验室进一步阐明了cluster assistance的一些内在特征及其在疾病相关的miRNA突变中的潜在作用【5】。虽然cluster assistance解释了suboptimal miRNA也可以被Microprocessor识别加工这一现象，但背后的分子机制并未完全被解析，尤其这其中涉及到的辅助蛋白因子-ERH和SAFB1/2的作用【3】。

在上述研究基础之上，近日，Eric Lai实验室的尚仁福及合作者在Genes & Development发表题为

Separable roles for Microprocessor and its cofactors, ERH and SAFB1/2, during microRNA cluster assistance

基于miR-144/451这一经典的suboptimal miRNA cluster，作者结合CRISPR knockout以及RNAi knockdown策略构建了ERH和SAFB1/2的单敲、双敲以及三敲除细胞系，证明ERH和SAFB1/2（尤其是SAFB2）都可以特异性的影响suboptimal miR-451的加工表达，但对同一cluster的optimal miR-144及其它control optimal miRNA没有影响。进一步的rescue实验发现SAFB2不仅可以恢复miR-451在SAFB2单敲细胞中的表达，也可以恢复miR-451在SAFB1/2双敲以及ERH/SAFB1/2三敲细胞中的表达，而ERH只能恢复miR-451在ERH单敲细胞中的表达。更有意思的是SAFB2还能部分恢复miR-451在ERH单敲细胞中的表达，这些证据暗示在cluster assistance中，SAFB2的作用可能处于ERH下游。

在之前的研究中【2】，作者提出了cluster assistance的三阶段模型：（1）optimal miRNA hairpin高效招募Microprocessor并加工其本身；（2）从optimal miRNA上释放的Microprocessor转移到附近的suboptimal miRNA；（3）Microprocessor识别并加工suboptimal miRNA hairpin。结合这一模型以及作者在之前研究中建立的Tethering Assay，证明ERH和SAFB2对第一阶段optimal miRNA的识别和加工没有任何影响，但对第二阶段及之后的过程是必需的。通过进一步只针对第三阶段的Tethering Assay及Microprocessor饱和实验验证，作者发现只有SAFB2对第三阶段的suboptimal miRNA的识别加工是必需的，ERH在这一阶段不是必需的。这也暗示ERH可能作用于第二阶段的Microprocessor从optimal miRNA到suboptimal miRNA的转移，当然也不能排除SAFB2同时作用于第二和第三阶段（图1）。

图1. ERH和SAFB2在miRNA cluster assistance中的作用方式

接下来一个绕不开的问题就是ERH和SAFB2是如何参与到cluster assistance当中的？之前的研究表明ERH跟Microprocessor中的DGCR8有相互作用，而SAFB2跟Drosha有相互作用，同时ERH与SAFB2也有直接相互作用，这导致多个关于cluster assistance的假设模型都与这些蛋白-蛋白相互作用有关。作者也通过实验仔细确认了辅助蛋白因子与Microprocessor的相互作用，尤其ERH通过形成homodimer的方式与DGCR8蛋白的N端区域展现了非常强以及特异的相互作用，与之前的报道一致【6】。但本研究中，作者在DGCR8敲除的细胞中发现补偿N端缺失（即失去了结合ERH的能力）的DGCR8也能恢复suboptimal miRNA的加工表达，甚至超过野生型DGCR8的补偿效果。另外，针对SAFB2与Drosha的相互作用，作者在Drosha敲除的细胞中补偿N端缺失的Drosha（即失去了结合SAFB2的能力）能达到与补偿野生型Drosha一样的对suboptimal miRNA加工表达的恢复作用。最后，作者在Drosha/DGCR8双敲的细胞中同时补偿不能结合ERH和SAFB2的Microprocessor突变体，结果同样可以高效恢复suboptimal miRNA的加工表达。以上证据表明，虽然ERH和SAFB2与Microprocessor有相互作用，但这些蛋白-蛋白相互作用对cluster assistance并不是必需的。有意思的是，作者发现SAFB2与DGCR8（而不是Drosha）存在相互作用，并且这个相互作用在Drosha敲除的细胞中变得更强，暗示了SAFB2可能通过DGCR8介入cluster assistance。作者还发现之前报道的ERH和SAFB2的相互作用在cluster assistance中也是非必需的。综上，虽然ERH、SAFB2、Drosha和DGCR8这些蛋白之间有相互作用，但这些蛋白-蛋白相互作用对cluster assistance都不是必需的，这些结论与最近来自Sebastian Herzog实验室的预印本研究高度一致【7】。当然，对于这一复杂的涉及多个蛋白因子以及至少两个miRNA hairpin的cluster assistance，其最终的分子机制还需要更多的后续研究。

接下来，针对不同的suboptimal miRNA往往有不同的suboptimal features，作者探究了ERH和SAFB2对miRNA底物的特异性。通过大量的结构突变分析，作者发现对于某些suboptimal特征不太突出的suboptimal miRNA，其旁边optimal miRNA的存在足以促进它们的高效加工表达，ERH和SAFB2在其中只起了有限的作用。对于hairpin结构比较差（尤其是失去了lower stem）的suboptimal miRNA，SAFB2展现了比ERH更强的对这些miRNA表达的促进作用。为进一步理解ERH和SAFB2的底物特异性，作者研究了它们对内源miRNA表达谱的影响。常规检测miRNA表达谱的小RNA深度测序方法只能反映成熟miRNA的表达水平，这一表达水平是miRNA上游加工调控和成熟miRNA稳态控制的综合作用结果。为了区分ERH和SAFB2（这两个蛋白因子都有很多其它细胞内功能，可能间接影响miRNA表达）是作用于miRNA的上游加工过程还是miRNA稳态控制，作者采用了SLAM-seq，即通过短时间标记新生RNA转录本，可以在一次深度测序中同时检测新生的miRNA（主要反映加工调控影响）和成熟的稳态miRNA（反映加工以及稳态控制的综合影响）。通过对野生型以及上述ERH、SAFB1/2的单敲、双敲及三敲除细胞中的小RNA表达谱进行SLAM-seq实验，作者发现ERH和SAFB1/2对内源miRNA的表达影响主要集中在上游加工调控，因为新生miRNA和稳态miRNA在这些突变细胞中的表达谱高度一致。同时，针对内源miRNA的表达谱分析揭示SAFB2对miRNA的表达影响比ERH更大，即SAFB2可以影响更多内源miRNA的表达。该分析也发现了很多新的受cluster assistance影响的suboptimal miRNAs，当然如果扩展到更多的组织或细胞中，肯定会有更多的suboptimal miRNA被揭示。最后，作者还发现一些内源miRNA只受ERH或者只受SAFB2的调控，暗示了ERH和SAFB2对某些内源miRNA的不依赖于cluster assistance的独立调控作用，这也与Sebastian Herzog实验室以及Narry Kim实验室近期的发现一致【7-8】。

最后，虽然cluster assistance可以通过影响suboptimal miRNA的表达来影响这些miRNA的靶基因的表达，cluster assistance是否可以直接作用于靶基因表达呢？在上述SLAM-seq中，作者发现存在于DGCR8 mRNA中的一个miRNA cluster （mir-3618/1306）的加工表达会受到ERH和SAFB2的影响。其中，miR-3618呈现optimal miRNA的结构特征，而miR-1306呈现明显的suboptimal miRNA特征。以往研究发现Microprocessor对这个miRNA cluster的加工会直接切割并降低DGCR8 mRNA的水平，进一步影响DGCR8蛋白和Microprocessor的表达，以及对内源miRNA的加工能力，形成了一个对Microprocessor的负反馈调控。本研究中，作者发现敲除ERH或者SAFB2都可以显著上调DGCR8以及Microprocessor的表达水平，当通过CRISPR删除该cluster中的optimal miR-3618 hairpin时，ERH和SAFB2对DGCR8的表达调控作用就消失了。也就是说ERH和SAFB2通过cluster assistance可以调控DGCR8 mRNA中的miRNA cluster的加工，进一步调控DGCR8蛋白和Microprocessor的表达水平，进而可能对内源miRNA产生全局性调控（图2）。需要指出的是，虽然名字中都有miR，miR-3618和miR-1306几乎不产生或只产生很少量的成熟miRNA，这提示cluster assistance也可能作用于其它非miRNA的RNA hairpin的加工调控，进而直接作用于这些RNA hairpin所在的宿主基因。

图2. Cluster assistance对Microprocessor负反馈调控的影响

总之，该文章在前期的发现之上，进一步揭示了辅助蛋白因子ERH和SAFB1/2在miRNA cluster assistance中的作用方式和对内源miRNA表达谱的影响，并揭示了一个cluster assistance对靶基因的直接生理调控作用。从最初的多个实验室同时报道，到现在一直有多个实验室在跟进cluster assistance这一重要的miRNA表达调控机制，但其最终的分子机制以及生物学意义仍有待进一步研究。

纪念斯隆-凯特琳癌症中心Eric Lai实验室的博士后尚仁福为该文章的第一作者，维也纳大学Stefan Ameres实验室的Niko Popitsch提供了SLAM-seq的生信分析，Eric Lai为通讯作者。该文章也被Genes & Development进行了Highlight报道【9】。

原文链接：https://doi.org/10.1101/gad.353316.125

制版人：十一

参考文献

1. Shang, R. et al. MicroRNAs in action: biogenesis, function and regulation.Nat Rev Genet24, 816-833 (2023).

2. Shang, R. et al. Genomic clustering facilitates nuclear processing of suboptimal pri-miRNA loci.MolecularCell78, 303-316 (2020).

3. Hutter, K. et al. SAFB2 enables the processing of suboptimal stem-loop structures in clustered primary miRNA transcripts.MolecularCell78, 876-889 (2020).

4. Fang, W. and Bartel, D. P. MicroRNA clustering assists processing of suboptimal microRNA hairpins through the action of the ERH protein.MolecularCell78, 289-302 (2020).

5. Shang, R. and Lai, E.C. Parameters of clustered suboptimal miRNA biogenesis.PNAS120(41), e2306727120 (2023).

6. Kwon, S.C. et al. ERH facilitates microRNA maturation through the interaction with the N-terminus of DGCR8.Nucleic AcidsRes48, 11097–11112 (2020).

7. Aschenwald, S. et al. Dual function of ERH in primary miRNA biogenesis.BioRxiv, (2025).

8. Jang, H. et al. ERH promotes primary microRNA processing beyond cluster assistance.NatureCommunications16(1):7913, (2025).

9. Sanborn, O. and Cifuentes, D. It takes two to cleave: the logic of cluster assistance.Genes & Development,(2026).

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