Science | 利用RNA引导的桥接重组酶在人类细胞中进行可编程基因组编辑

撰文|林无隅

CRISPR-Cas 基因组编辑技术虽然彻底改变了遗传疾病的治疗前景【1】，但第一代技术依赖于 DNA 双链断裂（ DSBs ），这可能导致基因毒性和不精确的修复结果【2】。尽管碱基编辑器和先导编辑器避免了 DSBs ，但它们在引入大片段 DNA 以治疗囊性纤维化等涉及多种突变的遗传疾病方面仍面临巨大挑战【3-4】。现有的如 PASSIGE 和 CRISPR 相关转座子等大片段插入技术【5】，往往受限于低效率、脱靶插入或产生基因组疤痕等问题 。因此，开发一种能够高效、精确地进行基因大小的 DNA 片段定点插入，且不依赖宿主同源重组修复途径的新型编辑工具，成为该领域亟待解决的关键问题 。

近日 ， 瑞士苏黎世大学生物化学系Martin Jinnek实验室在 Science 杂志发表了题为

Programmable genome editing in human cells using RNAguided bridge recombinases

为了寻找在人类细胞中更有效的桥接重组酶，研究人员对 10 种 IS110 家族的候选系统进行了筛选，最终发现源自 Citrobacter rodentium 的 ISCro4 表现出最高的重组活性 。通过对桥接 RNA 设计的优化，他们发现将原本连接在一起的 TBL 和 DBL 拆分为两个独立的 RNA 分子（即 split-bridge RNA ），可以大幅提升编辑效率，使转染细胞中的重组阳性率从约 36% 跃升至 68% 以上 。此外，实验还证明了这种拆分 RNA 设计具有稳健的可编程性，能够引导 ISCro4 在新的靶点和供体序列之间进行特异性重组 。

为了深入理解 ISCro4 高活性的结构基础，研究团队解析了分辨率为 2.8 Å 的 ISCro4 突触复合体冷冻电镜结构 。结构对比分析显示，与同家族的 IS621 相比， ISCro4 在与核酸结合的界面上存在关键的氨基酸差异，例如 Ser13 和 Ser63 位点，这些残基与向导 RNA 及 DNA 底物形成了额外的氢键相互作用 。此外，疏水核心和溶剂暴露表面的氨基酸替换也可能改善了酶在细胞内的溶解度和稳定性，这些结构特征共同赋予了 ISCro4 在哺乳动物细胞中更优越的性能 。

在应用层面，作者验证了 ISCro4 在多个临床相关基因位点上的编辑能力，包括切除 CNBP 基因中的致病性重复序列和翻转 CFTR 基因的第 23 号外显子，效率分别达到约 1% 和 4% 。更为重要的是，该系统实现了在 AAVS1 安全港位点定点插入 3.5 kb 的供体 DNA ，效率超过 6% ，且测序结果未显示由于双链断裂修复引起的插入缺失（ indels ） 。针对特异性的评估表明，虽然 ISCro4 存在一定的脱靶结合，但其重组活性主要局限于与向导 RNA 错配少于 2 个核苷酸的位点，且可以通过选择独特的基因组靶点和正交供体序列来进一步降低脱靶风险 。

综上所述，本研究证明了ISCro4与其优化的拆分桥接RNA系统相结合，能够作为一种高效、多功能的工具，在人类细胞中实现包括大片段插入在内的复杂基因组重排。通过详细的结构生物学分析和脱靶检测，该研究不仅阐明了 ISCro4 高效活性的分子机制，还提出了通过筛选独特靶点来规避脱靶效应的可行策略 。鉴于人类蛋白编码基因中绝大多数（ 94% ）都包含可被该系统识别的独特位点， ISCro4 为治疗那些现有技术难以攻克的、需要大片段基因矫正的遗传疾病提供了极具潜力的转化途径 。

http://doi.org/10.1126/science.adz1884 (2026).

制版人： 十一

参考文献

1. M. Pacesa, O. Pelea, M. Jinek, Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies.Cell187, 1076–1100 (2024).

2. M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.Nat. Biotechnol.36, 765–771 (2018).

3. E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale, CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.Nat. Med.24, 927–930 (2018).

4. A. V. Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis, A. A. Sousa, L. W. Koblan, J. M. Levy, P.J. Chen, C. Wilson, G. A. Newby, A. Raguram, D. R. Liu, Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149–157 (2019).

5. C. J. Tou, B. Orr, B. P. Kleinstiver, Precise cut-and-paste DNA insertion using engineered type V-K CRISPR-associated transposases.Nat. Biotechnol.41, 968979 (2023).

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