Adv Sci：基于结构色纳米腔的智能无染色组织学分析

论文信息：

Q. Chen, Y. Ren, L. Hu, Y. Li, W. Liang, J. Wang, H. Gao, X. Wang, J. Li, Q. He, Y. Zhu, H. Hu, Q. Zhan, I. Gallouzi, J. Merzaban, D. Wang, Z. Du, X. Gu, Q. Gan, Intelligent Stain‐Free Histology on Structural Colorimetric Nanocavities, Advanced Science (2026) e14340.

论文链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202514340.

研究背景

现代病理诊断离不开显微镜下对组织形态和颜色分布的判断，但临床金标准的苏木精-伊红染色不仅耗时费力、成本高，还会因为染液浓度波动和试剂质量差异带来一致性问题，而且诊断质量在很大程度上依赖病理医生的经验与主观判断，这在数字化与个体化医疗越来越强调标准化、可复制的背景下就成了瓶颈，于是人们开始探索免染色的组织学成像来降低化学染色的成本与劳动强度，不过已有方案要么依赖昂贵复杂的中红外或其他先进显微系统，要么像“虚拟染色”那样需要大量高质量训练数据和高端成像设备，最近出现的等离激元纳米孔阵列载玻片虽然能用常见明场显微镜在无标记切片上做出可用于判别的颜色对比，但其金属薄膜纳米图案的制备依旧昂贵复杂，难以规模化进入医院常规流程，因此迫切需要一种更便宜、更易制造、又能直接融入现有临床硬件并适合AI大规模数据采集的免染色组织学成像平台 。本文 开发了干涉纳米腔平面结构，只需简单的镀膜便可实现各种颜色。将病理切片贴上去之后，免去了传统染色步骤，可直接看到对比度清晰的细胞图，大幅度减少制样时间和花费。和人工智能结合，可以做到快速准确诊断。

研究内容

病理诊断里最常见的套路还是看 H&E 染色切片，但这个流程既费时费力，又容易受试剂浓度、染色液质量和操作一致性影响，结果还高度依赖病理医生经验，所以在追求标准化、数字化和更低成本的临床环境里就显得有点“老派又昂贵”了。过去十年出现过不少免染色思路，比如中红外光谱化学成像、虚拟染色等，但往往需要更复杂昂贵的成像设备或海量训练数据；即便是纳米光子芯片这种能在普通明场显微镜下做颜色对比的方案，也常被高成本的纳米加工卡住了。作者因此把目标定得很直接，用更便宜、更容易量产的平面纳米腔结构来做免染色组织学成像，并把后续 AI 辅助筛查也一并纳入同一条工作流里。

图 1 基于硅基结构色比色纳米腔（NOS）载玻片的先进无染色组织学分析。

(a) 智能组织学诊断示意图，插图为分层 NOS 载玻片结构设计。

(b) 12 片 6 英寸 NOS 晶圆的光学照片，插图展示干涉的光学机理。

(c) 对应的反射光谱。右上角标注了 Si₃N₄ 层厚度（单位：nm）；下方部分给出了未覆盖 Si₃N₄ 层的硅晶圆反射情况。

(d、e) 玻璃载玻片上连续切取、名义厚度为 2 μm 的人结直肠上皮组织切片的对比显微图像： (d) 未进行 H&E 染色；(e) 进行了 H&E 染色。

(f–k) 不同颜色的 NOS 载玻片，其中顶层 Si₃N₄ 厚度分别为： (f) 268 nm，(g) 243 nm，(h) 197 nm，(i) 158 nm，(j) 111 nm，(k) 85 nm。

所有图像均使用 10× 物镜（NA = 0.3）采集。图 d–k 的比例尺：50 μm。

图1主要在讲“底座”到底是什么，以及它为什么能让组织在不染色的情况下出现可读的颜色对比。NOS 玻片本质上就是在硅片上沉积一层纳米级厚度的氮化硅，通过反射光的薄膜干涉产生结构色，调一调氮化硅厚度就能得到一系列不同的底色与反射谱共振位置。然后作者把同一来源的结直肠上皮连续切片分别放在普通玻片和不同颜色的 NOS 玻片上做对比，能直观看到 NOS 提供的颜色层次明显更丰富，组织形态细节也更容易被“颜色差”带出来，为后面定量分析和诊断铺路。

图 2 硅基结构色比色纳米腔（NOS）载玻片的分析。

(a) 健康与癌变结肠组织的折射率（RI）分布图灰度图像；灰度值与 RI 对应。比例尺：10 μm。

(b) (a) 中组织 RI 值的统计分布。

(c) 在 CIE 色度图上模拟得到：厚度 0.5 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在绿色 NOS 载玻片上的颜色位置变化。

(d) 在 CIE 色度图上模拟得到：厚度 1 μm、折射率 n = 1.22–1.47 的材料在绿色 NOS 载玻片上的颜色位置变化。

(e) 人结直肠上皮组织切片的显微图像，标出用于计算与分析的健康区域（蓝框）和癌变区域（红框）。玻璃载玻片上的所有图像均由配备 20× 物镜（NA = 0.75）的 Leica Aperio 扫描仪获取；两幅 NOS 图像则使用 4× 物镜（NA = 0.13）拍摄。比例尺：200 μm。

(f) (e) 中绿色 NOS 载玻片对应区域的微区多光谱结果。

(g) 健康区域（蓝色，上面板）与癌变区域（红色，下面板）的 CIELAB 空间分布。

(h) 健康/癌变点云之间云点交并比（IoU）的小提琴图（中间虚线表示中位数，上/下虚线表示四分位距 IQR；每组 n = 25）。采用双侧独立样本 t 检验，玻璃 vs. NOS 的 p 值为 1.94×10⁻¹⁴，H&E vs. NOS 的 p 值为 5.80×10⁻¹⁰，二者在 α = 0.0001 水平上均具有显著性。

图2把“为什么会变色”这件事拆开来做定量解释，并证明这种颜色差确实能更好地区分健康与癌变区域。作者先用光学衍射层析测了组织的折射率分布，发现健康与癌变上皮的折射率统计分布峰值有明显差异；再结合 AFM 测到的真实厚度范围，用传输矩阵法去模拟在不同折射率与厚度下 NOS 颜色在 CIE 色度图上的漂移，说明很小的折射率或厚度变化就能带来人眼可感知的颜色差。最后他们把实际图像做成像素级 CIELAB 点云，用点云重叠度 IoU 来量化健康/癌变的颜色分离程度，结果显示 NOS 上的点云分离优于未染色玻片和传统 H&E。

图 3 H&E 染色与 NOS 载玻片图像中器官与组织病理连续切片的比较。

(a) 健康结直肠上皮，并给出放大的上皮细胞图像。

(b) 结直肠腺癌及低分化肿瘤。

(c) 健康/癌浸润的结直肠固有层。

(d) 健康/癌浸润的结直肠肌层。

(e) 健康/癌变乳腺（左列）、肺（中列）与甲状腺组织切片（右列）。

(f) 一例结直肠病例及其诊断结果。

玻璃载玻片上的所有图像均由配备 20× 物镜（NA = 0.75）的 Leica Aperio 扫描仪获取；两幅 NOS 图像则使用 10× 物镜（NA = 0.3）拍摄。图 a–e 的比例尺：100 μm；图 f 的比例尺：500 μm。

图3是在回答“这东西是不是只对某一种组织好用”以及“病理医生能不能直接拿它做判断”。他们拿了多器官样本做连续切片对照，在结直肠上皮、固有层、肌层等不同组织结构里，NOS 图像能复现 H&E 下关键的腺体结构、杯状细胞缺失、细胞异型性、浸润边界等诊断要点，并把这种能力扩展到乳腺、肺和甲状腺等组织。更关键的是还做了盲法对比读片，在一批结直肠病例里，用 NOS 图像给出的区域划分和 H&E 参考结果高度一致，用一致率和 Kappa 系数把“能用”这件事量化到了接近临床可接受的水平。

图 4 用于辅助评估的机器学习算法及其结果。

(a) AI 算法训练流程与辅助评估性能测试流程。

(b) 在测试数据集上测试得到的混淆矩阵。

(c) 模型的受试者工作特征（ROC）曲线，AUC 达到 0.987。

(d) 病理学家基于 H&E 染色图像对一张结直肠组织切片给出的病理诊断结果。

(e) 在与 (d) 对应的、NOS 载玻片上的连续无染色切片中，DenseNet121 模型给出的判别结果。比例尺：500 μm。

图4把前面“可读的结构色”顺手接到了 AI 上，展示了一个真正能跑起来的辅助评估流程。作者用 NOS 图像切块构建结直肠健康/癌变上皮数据集，按病人级别划分训练集和测试集，训练 DenseNet121 这类 CNN 做二分类，在测试集上给出高准确率以及很高的 AUC，并用混淆矩阵和 ROC 曲线把模型性能说清楚。更贴近临床的是他们把模型输出做成整片区域的颜色标注，去和病理医生在 H&E 上圈出的病灶范围对齐，结果显示模型在大尺度区域分割上也能较好复现人工标注，而且推理速度足够快，适合做批量筛查和预分诊。

结论与展望

文章提出一种可量产、低成本的免染色病理成像方案，在硅基底上沉积纳米厚度氮化硅形成结构色纳米腔(NOS)载玻片，用普通明场显微镜即可把无标记组织切片的微小厚度与折射率差异转化为显著颜色对比。作者通过光学衍射层析获得折射率分布、用AFM测厚，并以传输矩阵法解释不同组织在CIE色度空间的漂移，证明NOS能比常规未染色玻片与H&E在颜色点云上更好地区分健康与癌变区域。多器官连续切片对照显示NOS图像可呈现腺体结构、杯状细胞变化与浸润边界等关键病理特征，盲法读片一致性接近H&E。进一步构建结直肠数据集训练CNN实现高AUC分类，并生成整片病灶热图，展示了可直接接入数字病理与AI筛查的临床工作流。