ICH S13指导原则关键考量的工业界视角：寡核苷酸治疗药物的非临床安全性评价

寡核苷酸治疗药物（Oligonucleotide Therapeutics, ONTs）是一类成熟的药物，具有高度特异性的药理活性。本文所讨论的ONTs包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNA）、Antagomirs（miRNA抑制剂）、RNA编辑寡核苷酸、miRNA模拟物、小激活RNA（saRNA）。未纳入讨论的类型包括用于DNA编辑的(g)RNA、DNA/RNA疫苗以及编码型mRNA，因其作用机制存在显著差异。

ONTs通过与mRNA等分子靶点结合，调控特定致病蛋白或其变异体的表达，从而实现精准治疗。尽管ONTs在全身循环中清除较快，但在靶组织中可产生持久的药效学（PD）。这一特性使其具备“长效低频给药”的潜力。

由于其理化性质限制，ONTs常需局部给药，例如：1）鞘内注射（IT）：用于中枢神经系统（CNS）疾病；2）玻璃体内注射：用于眼部疾病；3）吸入给药：用于肺部靶向治疗。若采用全身给药（如皮下或静脉注射），通常需借助特殊递送技术以增强靶组织和细胞的摄取，包括：1）小分子偶联：如N-乙酰半乳糖胺（GalNAc，靶向肝细胞）；2）大分子偶联：如转铁蛋白受体1（TfR1）抗体；3）脂质纳米颗粒（LNP）包封。

从药物分类与监管现状的角度，ONTs既不属于传统小分子，也不完全等同于生物大分子。不过，与生物药有些相似，作用机制高度特异、药效持久、模拟天然生物学通路。但为化学合成，并常含化学修饰以提升稳定性、效力和持久性。

目前行业普遍依据以下ICH指南开发ONTs：ICH M3(R2)、ICH S6(R1)。然而，全球尚无专门针对ONTs的国际统一监管指南。目前主要依赖：行业实践、企业公开的非临床数据、跨行业工作组白皮书（如OSWG、EFPIA ONT非临床工作组）、已获批产品的公开审评报告。当然，日本PMDA已于2020年发布ONT专属指南，是目前少有的区域性专门指导文件。

在此背景下，鉴于ONTs作为治疗模式的日益成熟及其非临床开发的独特性，ICH于2024年初正式启动新安全议题 “ICH S13——寡核苷酸治疗药物的非临床安全性评价”：概念文件于2024年11月正式通过。同月，美国FDA也发布了相关草案指南《寡核苷酸治疗药物的非临床安全性评估》。

为向ICH S13制定提供产业视角，国际制药创新与质量联盟（IQ Consortium）下属的DruSafe ONT工作组（ONT WG）设立了专项任务组，旨在：识别ONT非临床开发中的关键考量，明确最需监管协调与澄清的领域。工作组成员频繁研讨，围绕ONT非临床安全性评价形成共识建议。

本文基于工作组成员的丰富行业经验、现有监管指南、科学文献和行业白皮书，提出关于ONT非临床安全性评价的核心建议与考量（见下图）。本文是产业界对即将出台的ICH S13国际指导原则的重要前期贡献，旨在推动ONT非临床开发的科学性、一致性与全球协调。

杂交依赖性脱靶效应分析

ONTs的一个潜在安全性风险是脱靶杂交依赖性效应，即ONT通过碱基互补配对意外结合并调控非目标转录本（mRNA等）。由于当前大多数ONT具有持久的药效学作用（持续数周至数月），识别并规避具有生物学意义的脱靶效应成为非临床安全性评价的关键环节。

行业共识建议（源自OSWG白皮书），关于脱靶识别与风险评估的行业推荐流程，主要包括以下四步：1）初步识别：利用生物信息学和转录组学方法，预测潜在的脱靶相互作用；2）聚焦相关细胞类型：仅在已证实ONT具有药理活性的细胞类型中开展深入分析，提高相关性；3）实验验证与安全窗评估：在人源细胞模型中实验验证生信预测的脱靶效应，并建立体外脱靶活性与靶向活性之间的剂量/效应比值（即体外安全边际）；4）风险后果评估：评估命中关键脱靶转录本可能带来的生物学或毒性后果（如调控关键通路、影响细胞功能等）。

IQ DruSafe工作组建议ICH S13专家工作组：采纳OSWG白皮书中的上述推荐；并明确脱靶评估应在药物开发的哪个阶段进行（例如：候选物确定前、IND申报前等），以确保科学性和可操作性。

动物活性替代分子的使用

当缺乏对候选ONT具有药理相关性的动物种属（即ONT在常规毒理试验动物中无活性）时，可采用啮齿类活性替代寡核苷酸（surrogate）开展非临床研究。该替代分子需能靶向动物体内同源基因（ortholog），用于评估药理作用过度放大所导致的毒性，如一般毒性或发育毒性。在生殖毒性研究中，也可作为减少非人灵长类（NHP）使用的策略。

IQ DruSafe工作组建议ICH S13明确以下要点：1）用途限定：替代分子仅应用于危害识别，不可直接外推临床风险，因其可能存在与临床候选物不同的脱靶谱（因序列差异导致杂交依赖性脱靶不同）；2）给药剂量与频率：应使用最低有效剂量和最少给药频次，以模拟人体预期的药理暴露水平；避免超药理剂量，否则可能引发物种特异性脱靶效应，与替代分子本身相关的非临床相关毒性；3）PK/TK：若在毒理研究中已明确观察到PD，则无需强制要求完整的PK/TK数据；4）分子设计要求：替代分子应尽可能与临床候选ONT保持一致，包括相同的化学骨架与修饰类型（如PS、2'-MOE、GalNAc等），相近的序列长度，相同的靶向机制（如偶联的配体/递送部分也需具备活性）。

目标是最大化替代分子的毒理相关性，确保其能真实反映临床候选物在人体中可能产生的药理介导毒性。

安全药理学

ONT WG建议：在可行情况下，将安全药理学评估整合到一般毒理学研究中，遵循ICH S7A、S7B及ICH S6(R1)的指导原则。安全药理学试验应在临床试验启动前完成，并参考OSWG的建议。

时间点选择需要注意。鉴于ONT具有持久的PD，动物研究中安全药理学评估的时间点应综合考虑：血浆达峰时间（Tmax）、最大药效作用时间。

关于hERG通道与心脏安全性：常规不推荐进行体外hERG抑制试验（即使用于TQT豁免），理由包括：ONT的理化特性（大分子、带负电、不易穿透细胞膜）；现有数据表明其心脏风险极低；与日本PMDA《寡核苷酸指南》一致。当然，也有些例外情况，可考虑开展hERG试验。比如靶点生物学或已证实的脱靶效应可能影响hERG表达或功能，或体内遥测研究中观察到QTc间期延长。

若进行hERG试验，反对测定细胞内药物浓度，原因包括：1）技术上难以区分：细胞内、膜结合、离子通道结合的药物；2）缺乏人体心肌组织药物浓度数据，结果难以解读。

其他体外次要药效学试验：不推荐常规开展针对其他离子通道、GPCRs、转运体或酶的体外筛选。这些方法是为小分子优化设计的，不适用于ONT。但支持在出现特定体内安全性信号后，回溯性增加相关体外机制研究。

一般毒理学

重复给药毒理研究需重点考虑：种属选择、给药途径、剂量选择、给药频率与周期、恢复期设置。

ONT通常靶向人类特异性序列，在非临床种属中药理活性有限；虽常全身给药，但局部给药（如鞘内、玻璃体内）也很常见。其特点是：血浆清除快，但组织半衰期长、药效持久——这要求采用不同于小分子或传统生物药的评估策略。

1.种属选择

当前行业惯例：使用啮齿类+非啮齿类（如猴）双种属，但许多ONT在啮齿类中无药理活性。为践行3R原则（减少动物使用）并依据ICH S6(R1)，ONT WG建议ICH S13考虑单一种属即可满足要求的情形，例如：1）无药理相关种属且无可用药理活性替代分子时（如外显子跳跃型ASO），可在FIH（首次人体）或慢性毒理研究中仅用单一种属；2）亚慢性研究未见明显毒性，或已知的动物毒性（如PS骨架ASO在猴中引起的补体激活）对人风险评估意义有限；3）偶联靶向配体（如单抗）：该配体仅与单一非临床种属交叉反应；或配体与ONT部分无共同的药理相关种属。

2.剂量选择

当前实践：行业通常结合ICH M3(R2)（小分子导向）与ICH S6(R1)（生物药导向）制定方案。

ONT WG核心建议：高剂量选择应优先遵循ICH S6(R1)，而非M3(R2)。原因是ONT血浆PK与组织PD脱钩。血中快速清除，但组织暴露持久、药效长期维持；M3(R2)基于50倍AUC安全边际，适用于小分子，但对ONT机制上不相关（毒性由组织内作用决定，非血浆暴露），技术上不可行（递送系统饱和，无法达到高AUC），易引发种属特异性假象（如猴特异性补体激活），降低临床相关性，增加不必要的动物使用。

S6(R1)推荐的高剂量设定原则，取以下两者中较高者：1）在毒理种属中实现最大预期药理作用的剂量；2）达到约10倍于人体最大临床暴露的剂量。超出此范围的进一步加量通常不提供额外价值。

因此，S6(R1)的“~10倍/最大药效”框架更科学、更符合3R原则。M3(R2)仅在评估化学结构特异性毒性或脱靶风险时酌情参考。

3.给药频率与周期

特点：临床给药频率远低于传统药物（如每月、每季度甚至更长）。部分ONT药效持续≥6个月。

建议ICH S13应明确：非临床给药方案如何支持人体延长给药间隔。

恢复组设置需考虑ONT的组织滞留特性：不要求在恢复期末达到“组织药物完全清除”或“靶基因PD完全回到基线”。恢复期应足以观察可逆性毒性（无论靶向或脱靶）的部分恢复。对于已充分表征、明确可逆的ONT类别效应（如某些肝酶升高），可豁免恢复组。

联合毒理学研究

当两种或多种ONTs作为复方产品共同开发时，ONT WG）建议ICH S13专家工作组（EWG）提供明确指导。

1.是否需要开展联合毒性研究？

若临床与非临床数据及药理学证据表明：联合用药不太可能产生相加、不可预测或协同毒性，则可考虑豁免专门的联合毒性研究（符合ICH M3(R2)原则）。

2.若需开展联合毒性研究，推荐方案如下：1）研究周期：90天重复给药毒性试验；2）种属数量：单一种属（需为药理相关种属）即可支持后期临床试验或上市申请。

3.其它考量因素

各ONT在毒理种属中的药理活性需要考虑。若某ONT在该种属中无药理活性，可考虑使用具有药理活性的替代分子参与联合研究。

剂量与给药频率设定依据：应基于各ONT的人体相关剂量与暴露水平，并结合其在动物模型中的药理反应强度。目标是确保联合毒性研究能真实反映临床联合用药的潜在风险，同时避免不必要的动物使用。

遗传毒性评估

基于EFPIA寡核苷酸非临床工作组的行业调研及其他研究（共涵盖多种ONT类别与化学修饰）：核心遗传毒性试验组合（如Ames、染色体畸变、微核试验）中未见阳性结果。

ONT不与DNA直接反应，迄今测试的各类化学修饰均未显示致突变性或染色体断裂作用。

理论上，若ONT的靶基因或脱靶mRNA参与DNA修复或细胞周期调控，可能间接影响基因组稳定性。但此类风险通常可通过靶点生物学评估和脱靶选择性分析予以识别和控制。

ONT WG具体建议：1）常规情况下可豁免遗传毒性试验：所用化学修饰已有充分遗传毒性数据支持其安全性。无证据表明其靶点或潜在脱靶机制具有遗传毒性风险。此时，应基于已有知识进行风险评估，无需开展体外或体内遗传毒性试验；2）使用新型化学修饰时：应按照ICH S2(R1)要求，进行标准遗传毒性试验组合以表征风险。上述建议与既往其他行业组织（如OSWG）的共识一致。

鉴于ONT遗传毒性风险极低，若确需开展体内试验，建议：将骨髓微核试验整合到重复给药毒性研究中，而非单独进行。无需每日给药，因ONT具有长组织半衰期，采用重复给药研究中的实际给药方案进行微核评估在科学上是合理的。

关于剂量考量与监管指导需求。重复给药毒性研究中的剂量通常达不到ICH S2(R1)规定的遗传毒性试验限值，且许多ONT在骨髓中的分布有限（相比肝、肾等器官）。因此，ICH S13应明确可接受的体内遗传毒性试验剂量标准，避免因剂量不足导致假阴性结论。

发育与生殖毒性

2023年，健康与环境科学研究所（HESI）DART委员会举办ONT专题研讨会，达成广泛共识：性成熟猴应作为DART评估的最后选择（即“最后手段”），以减少NHP使用。此观点与既往行业建议及ONT WG立场一致。

胚胎-胎仔发育研究（EFD）推荐采用两种种属：啮齿类+兔。依据ICH S5(R3)，仅需在其中一种种属中具备药理活性即可。若候选ONT在啮齿类和兔中均无药理活性，则应使用具有药理活性的替代分子与临床候选物一同开展一项或多项DART研究；或考虑使用表达人源靶点的转基因啮齿模型。若既无可用药理活性种属，又无法合理使用替代分子，仍应按要求在两个种属中进行EFD研究（即使无药理活性），以满足监管基本要求。

关于剂量设计建议：与一般毒理学一致，DART研究中的剂量水平与给药频率应能支持拟议的临床给药方案，ICH S13应对此提供明确指导。

致癌性评估

目前数据表明，ONTs的遗传毒性和致癌性风险极低。建议遵循现有ICH指南：ICH M3(R2)、ICH S1A/S1B(R1)。

推荐采用“证据权重法”（WoE）。特别适用于在大鼠/小鼠中无药理活性的ONT。不鼓励使用啮齿类替代分子进行致癌性研究，理由同ICH S6(R1)对生物药的规定：同源产品在致癌性研究中价值有限。

即使开展致癌性研究，也无法完全排除靶点相关的致癌风险（如长期抑制抑癌通路）。因此，优先采用WoE综合评估（整合靶点生物学、临床前/临床数据、机制信息等），而非强制追加使用种属特异性替代ONT的额外研究。

若必须使用替代ONT进行致癌性研究，应仅用于危害识别。研究设计需尽量避免脱靶效应干扰（如替代分子特有的基因调控），确保结果与人体候选物相关。

当已有研究发现以下啮齿类特异性肿瘤信号时，可认为与人无关，接受WoE结论：注射部位相关肿瘤、小鼠血管肉瘤、由慢性肝细胞损伤引起的肝肿瘤（若临床未观察到类似肝毒性）。

免疫毒性与血液学效应

ONT可能通过以下途径引发免疫反应。

补体激活：PS修饰的ONT（尤其是ASO）可抑制补体因子H，激活旁路补体通路。人源因子H的抑制能力约为NHP的3倍→NHP可能高估人体补体激活风险。此为某类ONT的类别效应，但具有一定序列依赖性。

Toll样受体（TLR）：可诱导促炎细胞因子释放。免疫刺激潜力同样具有序列特异性。

当前ONT设计通常规避免疫刺激基序，并引入化学修饰以降低风险。因此，无需常规开展广泛的体外/体内免疫毒性筛查。

ONT WG建议：免疫毒性评估应聚焦于特定风险（如ONT类型、化学骨架、已知机制），避免“一刀切”式测试。

血液学效应：血小板减少与凝血异常。PS骨架ASO在临床前和临床中偶见血小板减少、凝血参数改变（如PT、aPTT、纤维蛋白原）。机制尚不明确，可能涉及免疫性或非免疫性途径。NHP毒理研究中应常规监测血小板计数、纤维蛋白原、PT、aPTT等。免疫介导的血小板减少因发生率低，通常需在后期临床试验中确认。不推荐默认开展体外免疫毒性或凝血机制试验，仅在出现相关信号时（如动物或早期临床数据提示风险）按需进行——与FDA 2024年草案指南一致。

抗药抗体（ADA）：ONT WG建议ICH S13明确，在重复给药毒理研究中何时需检测ADA。ADA检测应触发条件包括TK特征显著改变；PD反应异常；出现无法解释的毒性。为便于评估，建议前瞻性采集并储存血清样本。

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